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中华口腔医学研究杂志(电子版)

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2023, Vol. 17 ›› Issue (05) : 335 -344. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2023.05.004

论著

脂多糖通过促进透明质酸受体CD44向核转移介导牙周膜细胞白细胞介素6释放
徐燕群, 李平, 杨兴, 薛慧†()   
  1. 南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院口腔科，苏州　215008
    南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院中心实验室，苏州　215008
    南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院骨科，苏州　215008
  • 收稿日期:2023-05-23 出版日期:2023-10-01
  • 通信作者: 薛慧

Lipopolysaccharide mediates interleukin-6 release from periodontal ligament cells by promoting hyaluronan receptor CD44 transfer to nuclear

Yanqun Xu, Ping Li, Xing Yang, Hui Xue†()   

  1. Department of Stomatology, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China
    Department of Central Laboratory, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China
    Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China
  • Received:2023-05-23 Published:2023-10-01
  • Corresponding author: Hui Xue
  • Supported by:
    Program of Jiangsu Science and Technology Department(BE2022737); Suzhou Science and Technology Development Project(SYSD2020245, SYS2020177); The Fifth Gusu Health Personnel Training Program of Suzhou(GSWS2019062); Gusu Health Personnel Training Program of Suzhou(GSWS2020077); Science and Technology Project of Ke Jiao Xing Wei(KJXW2021039)
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引用本文：

徐燕群, 李平, 杨兴, 薛慧. 脂多糖通过促进透明质酸受体CD44向核转移介导牙周膜细胞白细胞介素6释放[J]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2023, 17(05): 335-344.

Yanqun Xu, Ping Li, Xing Yang, Hui Xue. Lipopolysaccharide mediates interleukin-6 release from periodontal ligament cells by promoting hyaluronan receptor CD44 transfer to nuclear[J]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2023, 17(05): 335-344.

目的

初步探讨炎症状态下人牙周膜细胞（hPDLC）炎症反应的分子作用机制。

方法

利用细胞免疫荧光法鉴定原代培养hPDLC波形丝蛋白、角蛋白，使用不同浓度（0、0.1、10和100 μmol/L）的脂多糖（LPS）刺激hPDLC，流式细胞术检测细胞凋亡水平。选择不同的LPS刺激时间，酶联免疫检测方法（ELISA）检测细胞培养上清中透明质酸受体CD44的表达。使用ELISA、蛋白免疫印迹（Western blot）及细胞免疫荧光法等实验技术检测hPDLC在炎症环境下细胞质与细胞核中CD44、基质金属蛋白酶14（MMP-14）的表达变化，微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）检测炎症因子的表达。进一步在炎症环境下加入MMP-14、Importin β抑制剂，使用ELISA法检测细胞核内CD44的表达及定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测细胞白细胞介素6（IL-6）mRNA表达水平。

结果

不同浓度（0.1、1、10、100 μmol/L）LPS不会对hPDLC的凋亡产生影响。在1 μmol/L LPS刺激hPDLC 4 h后，MMP-14荧光强度表达明显增强（233.75），对照组为107.53，差异有统计学意义（t = 10.10，P<0.001）。CD44荧光强度为106.7，对照组为84.58，差异有统计学意义（t = 3.13，P = 0.02）。使用MMP-14抑制剂能够明显抑制细胞培养上清中CD44的表达，LPS+MMP-14抑制剂组较LPS组CD44表达明显下调，差异有统计学意义（t = 5.03，P = 0.001）。LPS刺激hPDLC会导致细胞核内CD44与Importin β表达量增加，差异有统计学意义（P<0.001）。LPS刺激后细胞核内CD44与Importin β也有上调表达的趋势，LPS会导致IL-6表达量增加，差异有统计学意义（P<0.001），并且LPS加入Importin β抑制剂后细胞中IL-6 mRNA的表达量较LPS处理组明显减少，差异有统计学意义（t = 16.79，P<0.001）。

结论

LPS能够导致hPDLC CD44、Importin β与IL-6的上调表达，核内CD44上调表达显著，MMP-14、Importin β抑制剂能够抑制炎症环境下CD44入核，抑制IL-6上调表达。提示在炎症状态下MMP-14与CD44参与hPDLC炎症反应，CD44能够向细胞核内转移介导IL-6的释放。

关键词: 牙周炎, 人牙周膜细胞, 脂多糖, 透明质酸受体, CD44, 白细胞介素6
Objective

To investigate the molecular mechanism of inflammatory response in human periodontal ligament cells (hPDLCs) under inflammatory conditions.

Methods

Vimentin and keratin were identified by immunofluorescence. hPDLCs were stimulated with different concentrations (0, 0.1, 10, 100 μmol/L) of lipopolysaccharide (LPS) , and apoptosis was detected by flow cytometry. The expression of hyaluronan receptor CD44 in cell culture supernatant was detected by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) after the LPS stimulation. The expression of CD44 and matrix metalloproteinase (MMP) -14 in the cytoplasm and nucleus of hPDLCs in inflammatory environment was detected by ELISA, Western blot and cell immunofluorescence. The expression of inflammatory factors was detected by Cytometric Bead Array (CBA) . Furthermore, MMP-14 and Importin β inhibitor were added in the inflammatory environment, and the expression of CD44 and interleukin-6 (IL-6) mRNA was detected by ELISA and RT-PCR, respectively.

Results

LPS did not affect the apoptosis of hPDLCs at different concentrations (0.1, 1, 10, 100 μmol/L) . After 4 h stimulation with 1 μmol/L LPS, the fluorescence intensity of MMP-14 in hPDLCs significantly increased (233.75) , while that in control group was 107.53, and the difference was statistically significant (t = 10.10, P<0.001) . CD44 fluorescence intensity was 106.7 in the LPS group and 84.58 in the control group, and the difference was statistically significant (t = 3.13, P = 0.02) . MMP-14 inhibitor could significantly inhibit the expression of CD44 in cell culture supernatant, and the expression of CD44 in the LPS+MMP-14 inhibitor group was significantly lower than that in the LPS group, and the difference was statistically significant (t = 5.03, P = 0.001) . LPS stimulation of hPDLCs increased the expression of CD44 and Importin β in the nucleus, and the difference was statistically significant (P<0.001) . After LPS stimulation, the expression of CD44 and Importin β in the nucleus was also up-regulated. LPS increased the expression of IL-6, and the difference was statistically significant (P<0.001) , and the expression of IL-6 mRNA in the cells treated with LPS plus Importin β inhibitor was significantly lower than that in the LPS treatment group. The differences were statistically significant (t = 16.79, P<0.001) .

Conclusions

LPS can up-regulate the expression of CD44, Importin β and IL-6 in hPDLCs. MMP-14 and Importin β inhibitor can inhibit the nuclear translocation of CD44 and the up-regulated expression of IL-6 in inflammatory environment. These results suggested that MMP-14 and CD44 participated in the inflammatory response of hPDLCs under inflammatory conditions, and CD44 can transfer to the nucleus and mediate the release of IL-6.

Key words: Periodontitis, Human periodontal ligament cells, Lipopolysaccharide, Hyaluronan receptors, CD44, Interleukin-6
图1 人牙周膜细胞（hPDLC）形态观察与鉴定　A：原代细胞（倒置显微镜）；B：第三代细胞（倒置显微镜）；C：原代细胞波形丝蛋白阳性（免疫荧光，共聚焦显微镜）；D：原代细胞角蛋白阴性（蓝色为DAPI核染色，免疫荧光，共聚焦显微镜）。
图2 流式细胞术检测不同浓度脂多糖（LPS）刺激人牙周膜细胞（hPDLC）凋亡情况　A：流式细胞术检测细胞凋亡图；B：细胞凋亡数据碘化丙啶（PI）平均荧光强度统计图。
图3 流式细胞术检测1 μmol/L脂多糖（LPS）刺激人牙周膜细胞（hPDLC）4 h后的蛋白表达　A：MMP-14表达的流式细胞单参数图；B：MMP-14平均荧光强度统计图；C：CD44表达的流式细胞单参数图；D：CD44平均荧光强度统计图；黑色小圆点代表各组的重复数值，采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.001，bP<0.05。
图4 ELISA法检测人牙周膜细胞（hPDLC）培养上清CD44表达　A：不同时间条件下1 μmol/L脂多糖（LPS）刺激hPDLC后细胞培养上清中CD44含量检测；B：对照组、LPS组及LPS+MMP-14抑制剂组hPDLC细胞培养上清中CD44含量检测；黑色小圆点代表各组的重复数值，采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.05，bP<0.001。
图5 脂多糖（LPS）刺激CD44入核相关指标检测　A：不同时间条件下1 μmol/L LPS刺激人牙周膜细胞（hPDLC），ELISA检测胞质CD44相对表达量变化；B：不同时间条件下1 μmol/L LPS刺激hPDLC，ELISA检测细胞核中CD44相对表达量变化；黑色小圆点代表各组的重复数值，采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.001。
图6 蛋白免疫印迹法检测细胞及细胞核对照组及1 μmol/L脂多糖（LPS）组中蛋白表达　A：蛋白免疫印迹法检测结果；B：对A图中对照组及LPS组细胞总CD44蛋白表达灰度值进行数据统计分析；C：对A图中对照组及LPS组Improtin β蛋白表达灰度值进行数据统计分析；D：对A图中对照组及LPS组细胞核CD44蛋白表达灰度值进行数据统计分析；采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.05。
图7 细胞免疫荧光检测及CD44表达ELISA法检测　A：细胞免疫荧光检测人牙周膜细胞（hPDLC）中CD44与Importin β表达（高倍放大）；B：ELISA法检测对照组、脂多糖（LPS）组、Importin β抑制剂组及LPS+Importin β抑制剂组hPDLC细胞核中CD44含量检测；采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.001。
图8 脂多糖（LPS）影响白细胞介素6（IL-6）的表达　A：对照组及1 μmol/L LPS组刺激人牙周膜细胞（hPDLC）培养上清中炎症因子表达CBA流式细胞图；B：对照组及1 μmol/L LPS刺激组刺激hPDLC培养上清中IL-6的表达量统计图；C：ELISA检测对照组及1 μmol/L LPS组hPDLC培养上清中IL-6的分泌；D：使用Importin β抑制剂后检测对照组、LPS组、Importin β抑制剂组及LPS+Importin β抑制剂组细胞中IL-6 mRNA表达；采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，aP<0.001。
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