脂磷壁酸诱导根尖骨吸收调控蛋白的表达

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.05.004

目的

研究难治性根尖周炎重要病原菌粪肠球菌脂磷壁酸对骨吸收核心调控系统，核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）蛋白表达的影响。

方法

采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测0.1、1.0、10.0、20.0 mg/L 脂磷壁酸作用24、48、72 h 后对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）增殖的影响。细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测脂磷壁酸刺激HPDLFs 24 h 后RANKL、OPG 表达水平及RANKL/OPG 值的变化。

结果

脂磷壁酸抑制HPDLFs 增殖具有浓度和时间依赖性。 10.0 mg/L 脂磷壁酸刺激24 h 后，HPDLFs 中RANKL、OPG 蛋白表达均增加，RANKL的增长速度较OPG 快，脂磷壁酸上调RANKL/OPG 值具有浓度依赖性，高浓度组明显大于对照组（P＜0.05）。

结论

脂磷壁酸对牙周膜成纤维细胞增殖具有抑制作用，可上调细胞RANKL、OPG 表达及RANKL/OPG 值，推测其在难治性根尖周炎骨吸收中扮演重要作用。

关键词: 脂磷壁酸, 根尖周炎, 核因子κB 受体活化因子配体, 骨保护素, 骨吸收

Objective

To explore the effect of the pathogenic bacteria of refractory periapical periodontitis， Enterococcus faecalis lipoteichoic acid on bone resorption， and to investigate the protein expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） as well as osteoprotegerin （OPG）in HPDLFs stimulated by lipoteichoic acid.

Methods

MTT chromatometry was used to determine HPDLFs activity after stimulated by 0.1， 1.0， 10.0 and 20.0 mg/L lipoteichoic acid for 24， 48 and 72 h.In addition， HPDLFs were collected after stimulation with lipoteichoic acid for 24 h. The protein expression of RANKL and OPG in HPDLFs were then evaluated by cell immunofluorescence and western blotting.

Results

Lipoteichoic acid inhibited HPDLFs viability in a dose-and-time-dependent fashion.RANKL and OPG protein level were both significantly up-regulated after stimulation with 10.0 mg/L Lipoteichoic acid for 24 h. The growth rate of RANKL was faster than OPG. Therefore， the ratio of RANKL/OPG was up-regulated by lipoteichoic acid in a dose-dependent fashion. The gray values and the ratio of the lipoteichoic acid high concentration group were statistically higher than those of the control group （P＜0.05）.

Conclusions

Lipoteichoic acid could inhibit HPDLFs proliferation， and upregulate both the protein expression and the ratio of RANKL/OPG. This indicated that lipoteichoic acid might play a crucial role in refractory periapical periodontitis.

Key words: Lipoteichoic acid, Periapical periodontitis, Receptor activator of nuclear factorκB ligand, Osteoprotegerin, Bone resorption

图1 培养5～14 d 后，HPDLFs 倒置显微镜下观（SABC ×200）HPDLFs 波形丝蛋白染色阳性，细胞浆呈绿色

表1 LTA 刺激HPDLFs 后细胞增殖抑制率［n=5，（±s）%］

组别	抑制率
组别	24 h	48 h	72 h
空白对照组	0.00±2.92	0.00±10.60	0.00±3.18
0.1 mg/L组	8.04±4.55^a	11.21±5.53^a	11.49±3.05^a
1.0 mg/L组	9.07±3.33^b	15.30±2.45^bc	13.92±4.74^b
10.0 mg/L组	14.69±1.77^a	26.38±4.32^ac	38.50±3.37^ac
20.0 mg/L组	18.27±6.62^b	26.51±5.56^bc	39.79±3.15^bc

表1 LTA 刺激HPDLFs 后细胞增殖抑制率［n=5，（±s）%］

组别	抑制率
组别	24 h	48 h	72 h
空白对照组	0.00±2.92	0.00±10.60	0.00±3.18
0.1 mg/L组	8.04±4.55^a	11.21±5.53^a	11.49±3.05^a
1.0 mg/L组	9.07±3.33^b	15.30±2.45^bc	13.92±4.74^b
10.0 mg/L组	14.69±1.77^a	26.38±4.32^ac	38.50±3.37^ac
20.0 mg/L组	18.27±6.62^b	26.51±5.56^bc	39.79±3.15^bc

图2 对照组HPDLFs RANKL 蛋白表达（Alexa Fluor 488 荧光素 × 400）

图3 LTA 刺激细胞24 h 后RANKL 蛋白表达（Alexa Fluor 488 荧光素 × 400）

图4 LTA 刺激细胞24 h 后OPG 蛋白表达（Cy3 荧光素 × 400）

图5 对照组HPDLFs OPG 蛋白表达（Cy3 荧光素 × 400）

表2 LTA 刺激HPDLFs 后RANKL、OPG 蛋白相对表达量（±s）

组别	RANKL/GAPDH	OPG/GAPDH	RANKL/OPG
空白对照组	0.0658±0.0045	0.6222±0.0558	0.1059±0.0049
0.1 mg/L组	0.0458±0.0017	0.4227±0.0280	0.1085±0.0055
1.0 mg/L组	0.1557±0.0279	0.3623±0.0132	0.4283±0.0640^a
10.0 mg/L组	0.6007±0.0233^a	0.9729±0.1179	0.6237±0.0828^a
20.0 mg/L组	0.8537±0.1623^a	1.4709±0.3522^a	0.6060±0.2104^a

表2 LTA 刺激HPDLFs 后RANKL、OPG 蛋白相对表达量（±s）

组别	RANKL/GAPDH	OPG/GAPDH	RANKL/OPG
空白对照组	0.0658±0.0045	0.6222±0.0558	0.1059±0.0049
0.1 mg/L组	0.0458±0.0017	0.4227±0.0280	0.1085±0.0055
1.0 mg/L组	0.1557±0.0279	0.3623±0.0132	0.4283±0.0640^a
10.0 mg/L组	0.6007±0.0233^a	0.9729±0.1179	0.6237±0.0828^a
20.0 mg/L组	0.8537±0.1623^a	1.4709±0.3522^a	0.6060±0.2104^a

图6 蛋白质印迹法检测不同质量浓度LTA 刺激HPDLFs 24 h 后RANKL、OPG 蛋白表达

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Expression of periapical bone resorption-regulating proteins induced by lipoteichoic acid

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