粪肠球菌脂磷壁酸对巨噬细胞自噬的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2018.02.001

目的

通过研究粪肠球菌脂磷壁酸（LTA）对巨噬细胞自噬功能的影响，为后续进一步深入探讨顽固性根尖周炎的发病机制提供实验依据。

方法

体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LTA的细胞毒性作用；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测LTA作用下巨噬细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1的表达水平；实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测自噬相关基因LC3、Beclin1 mRNA表达水平的变化；构建稳定表达自噬双荧光慢病毒载体HBLV-mRFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系，激光共聚焦显微镜观察自噬情况；SPSS 20.0统计软件进行数据分析。

结果

CCK-8结果表明，选用20 μg/mL LTA及其以下浓度处理巨噬细胞24 h均未见明显毒性作用（t = 2.102，P = 0.1106）；Western blot结果表明，LTA刺激巨噬细胞后：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值表达量（0.42 ± 0.04）与对照组（0.04 ± 0.02）相比显著提高，差异有统计学意义（F = 14.25，P<0.001），Beclin1蛋白表达量（0.56 ± 0.11）与对照组（0.28 ± 0.08）相比呈上升趋势（F = 3.459，P = 0.0258），均存在剂量依赖效应；实时荧光定量PCR结果表明，LTA刺激巨噬细胞后，LC3基因表达水平（5.94 ± 0.85）与对照组（1.03 ± 0.28）相比显著提高（F = 12.93，P<0.001）；Beclin1基因表达水平（2.22 ± 0.21）与对照组（1.02 ± 0.28）相比呈上升趋势（F = 6.036，P<0.001），存在剂量依赖效应；成功构建稳定表达HBLV-mRFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系，激光共聚焦显微镜下观察显示，LTA作用组自噬体形成量（58 ± 6）与对照组（18 ± 8）相比差异有统计学意义（F = 12.36，P = 0.0021）。

结论

粪肠球菌LTA可诱导巨噬细胞产生自噬，且存在剂量依赖效应。

关键词: 粪肠球菌, 脂磷壁酸, 巨噬细胞, 自噬

Objective

By investigating the effect of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid (LTA) on macrophages autophagy, this study aimed to provide experimental evidence for further exploration of the pathogenesis of persistent periapical periodontitis.

Methods

RAW 264.7 was cultured and cell counting kit-8 (CCK-8) was used to detect the cytotoxicity of LTA. Western blot was used to detect the expression level of autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin1 and qPCR was applied to detect the expression level of LC3 and Beclin1. RAW 264.7 cell strain stably expressing HBLV-mRFP-GFP-LC3-PURO was established, and laser confocal microscopy was used to observe the formation of autophagosome. SPSS 20.0 statistical software for data analysis.

Results

The result of CCK-8 showed no obvious toxicity to macrophage when stimulated with 20 μg/mL and the lower concentration of LTA for 24 hours (t = 2.102, P = 0.1106) . After LTA stimulated, Western blot suggested that the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ (0.42 ± 0.04) and Beclin1 (0.56 ± 0.11) significantly increased with dose-dependent effect (F = 14.25, P<0.001; F = 3.459, P = 0.0258) . In the meanwhile, qPCR results showed that the expression of LC3 (5.94 ± 0.85) and Beclin1 (2.22 ± 0.21) significantly increased with dose-dependent effect (F_LC3 = 12.93, P_LC3<0.001; F_Beclin1 = 6.036, P_Beclin1<0.001) after LTA stimulated. Laser confocal microscopy detected that LTA group (58 ± 6) had significant difference (F = 12.36, P = 0.0021) compared with control group (18 ± 8) .

Conclusion

Enterococcus faecalis LTA may regulate macrophages autophagy with dose-dependent effect.

Key words: Enterococcus faecalis, Lipoteichoic acid, Macrophages, Autophagy

表1 细胞相对增值率（RGR）与细胞毒级对应关系^[7]

RGR(%)	毒级
≥100	0
75 ~ 99	1
50 ~ 74	2
25 ~ 49	3
1 ~ 24	4
0	5

表1 细胞相对增值率（RGR）与细胞毒级对应关系^[7]

RGR(%)	毒级
≥100	0
75 ~ 99	1
50 ~ 74	2
25 ~ 49	3
1 ~ 24	4
0	5

表2 实时荧光定量PCR引物序列

基因	引物序列
LC3	F:5′-GAGCGAGTTGGTCAAGAT-3′
?	R:5′-TCATCCTTCTCCTGTTCATAG-3′
Beclin1	F:5′-AGTTGGGTGATGTGGGGAAAG-3′
?	R:5′-CGTCGCACACAGTATCAAACA-3′
GADPH	F:5′-GGGAAATCGTGCGTGAC-3′
?	R:5′-AGGCTGGAAAAGAGCCT-3′

表2 实时荧光定量PCR引物序列

基因	引物序列
LC3	F:5′-GAGCGAGTTGGTCAAGAT-3′
?	R:5′-TCATCCTTCTCCTGTTCATAG-3′
Beclin1	F:5′-AGTTGGGTGATGTGGGGAAAG-3′
?	R:5′-CGTCGCACACAGTATCAAACA-3′
GADPH	F:5′-GGGAAATCGTGCGTGAC-3′
?	R:5′-AGGCTGGAAAAGAGCCT-3′

图1 不同浓度脂磷壁酸（LTA）刺激巨噬细胞RAW 264.7不同时长的细胞活性

图2 不同浓度脂磷壁酸（LTA）刺激巨噬细胞24 h自噬相关蛋白相对表达量变化

图3 不同浓度脂磷壁酸（LTA）刺激巨噬细胞24 h自噬相关基因表达变化

图4 激光共聚焦显微镜下不同浓度脂磷壁酸（LTA）作用24 h后巨噬细胞自噬情况

[1]	Mg S. Contemporary Oral Microbiology and Immunology[M]. 1st edn ed. St. Louis，Missouri，USA：Mosby，1992：59-62.
[2]	凌均棨.难治性根尖周炎的感染控制与显微治疗策略[Z]//全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编，重庆，2009.重庆：中华口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会，2009.
[3]	Zhang C，Du J，Peng Z. Correlation between Enterococcus faecalis and Persistent Intraradicular Infection Compared with Primary Intraradicular Infection：A Systematic Review[J]. J Endod，2015，41（8）：1207-1213.
[4]	Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，et al. Enterococcus faecalis：its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment[J]. J Endod，2006，32（2）：93-98.
[5]	Mizushima N. Autophagy：process and function[J]. Genes Dev，2007，21（22）：2861-2873.
[6]	Cadwell K. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways：balancing defence and homeostasis[J]. Nat Rev Immunol，2016，16（11）：661-675.
[7]	中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB/T 16886.5-2017/ISO 10993-5：2009医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[S].北京：中国标准出版社，2017.
[8]	Nair PN. On the causes of persistent apical periodontitis：a review[J]. Int Endod J，2006，39（4）：249-281.
[9]	Zhao L，Chen J，Cheng L，et al. Effects of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid on receptor activator of nuclear factor-κB ligand and osteoprotegerin expression in periodontal ligament fibroblasts[J]. International Endodontic Journal，2014，47（2）：163-172.
[10]	Wan J，Ma J，Anand V，et al. Morphine potentiates LPS-induced autophagy initiation but inhibits autophagosomal maturation through distinct TLR4-dependent and independent pathways[J]. Acta Physiologica，2015，214（2）：189-199.
[11]	Abada A，Elazar Z. Getting ready for building：signaling and autophagosome biogenesis[J]. EMBO Rep，2014，15（8）：839-852.
[12]	Zou J，Shankar N. The opportunistic pathogen Enterococcus faecalis resists phagosome acidification and autophagy to promote intracellular survival in macrophages[J]. Cellular Microbiology，2016，18（6）：831-843.
[13]	Gomes LC，Dikic I. Autophagy in antimicrobial immunity[J]. Mol Cell，2014，54（2）：224-233.
[14]	Yuan K，Huang C，Fox J，et al. Autophagy plays an essential role in the clearance of Pseudomonas aeruginosa by alveolar macrophages[J]. J Cell Sci，2012，125（Pt 2）：507-515.
[15]	Li Y，Lu L，Luo N，et al. Inhibition of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway protects against d-galactosamine/lipopolysaccharide-induced acute liver failure by chaperone-mediated autophagy in rats[J]. Biomed Pharmacother，2017（92）：544-553.
[16]	Liu X，Wang Y，Cao Z，et al. Staphylococcal lipoteichoic acid promotes osteogenic differentiation of mouse mesenchymal stem cells by increasing autophagic activity[J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，485（2）：421-426.
[17]	Shi CS，Kehrl JH. TRAF6 and A20 regulate lysine 63-linked ubiquitination of Beclin-1 to control TLR4-induced autophagy[J]. Sci Signal，2010，3（123）：ra42.
[18]	Glick D，Barth S，Macleod KF. Autophagy：cellular and molecular mechanisms[J]. J Pathol，2010，221（1）：3-12.
[19]	Ni H，Bockus A，Wozniak AL，et al. Dissecting the dynamic turnover of GFP-LC3 in the autolysosome[J]. Autophagy，2014，7（2）：188-204.
[20]	Kimura S，Fujita N，Noda T，et al. Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3[J]. Methods Enzymol，2009（452）：1-12.
[21]	He J，Zhang G，Pang Q，et al. SIRT6 reduces macrophage foam cell formation by inducing autophagy and cholesterol efflux under ox-LDL condition[J]. FEBS J，2017，284（9）：1324-1337.

[1]	李康, 冀亮, 赵维, 林乐岷. 自噬在乳腺癌生物学进展中的双重作用[J]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2023, 17(04): 195-202.
[2]	孔莹莹, 谢璐涛, 卢晓驰, 徐杰丰, 周光居, 张茂. 丁酸钠对猪心脏骤停复苏后心脑损伤的保护作用及机制研究[J]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2023, 16(05): 355-362.
[3]	陆宜仙, 张震涛, 夏德萌, 王家林. 巨噬细胞极化在骨质疏松中调控作用及机制的研究进展[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2023, 18(06): 538-541.
[4]	周子慧, 李恭驰, 李炳辉, 王知, 刘慧真, 王卉, 邹利军. 细胞自噬在创面愈合中作用的研究进展[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2023, 18(06): 542-546.
[5]	王鹏, 肖厚安, 贾赤宇. 不同因素调控巨噬细胞极化在慢性难愈性创面中的研究进展[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2023, 18(05): 454-459.
[6]	张永博, 张亮, 陈浏阳, 戴睿, 孙华, 杨盛, 孟博, 彭晴. 线粒体与椎间盘退变[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2023, 18(03): 265-269.
[7]	邵浩仁, 郭佳. 铁死亡的分子机制及其在前列腺癌治疗中的研究进展[J]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2023, 17(03): 294-298.
[8]	张燕珍, 王锡携, 文小兰. 血清巨噬细胞迁移抑制因子对活动性肺结核分诊检测的意义[J]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2023, 16(02): 200-202.
[9]	刘燕, 叶亚萍, 郑艳莉. 干扰LINC00466通过miR-493-3p/MIF抑制子宫内膜癌RL95-2细胞恶性生物学行为[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2023, 13(03): 151-158.
[10]	沃吟晴, 杨向群. 心脏巨噬细胞的生理功能及在心肌梗死后的作用[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2023, 13(03): 167-171.
[11]	金艳盛, 董改琴, 李晓忠. 巨噬细胞在慢性肾脏病患者血管钙化中的作用与机制研究进展[J]. 中华肾病研究电子杂志, 2023, 12(04): 234-237.
[12]	吴琼, 朱国贞. 膜性肾病中M2巨噬细胞相关基因的生物信息学分析[J]. 中华肾病研究电子杂志, 2023, 12(03): 156-162.
[13]	王小红, 钱晶, 翁文俊, 周国雄, 朱顺星, 祁小鸣, 刘春, 王萍, 沈伟, 程睿智, 秦璟灏. 巯基丙酮酸硫基转移酶调控核因子κB信号介导自噬对重症急性胰腺炎大鼠的影响及机制[J]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2023, 13(06): 422-426.
[14]	郭如烨, 孟黎明, 陈楠, 宋玉莹, 尹海燕, 郭岩. Apelin/APJ系统对帕金森病模型的神经保护作用及机制研究进展[J]. 中华诊断学电子杂志, 2023, 11(04): 276-282.
[15]	邱甜, 杨苗娟, 胡波, 郭毅, 何奕涛. 亚低温治疗脑梗死机制的研究进展[J]. 中华脑血管病杂志(电子版), 2023, 17(05): 518-521.

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