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中华口腔医学研究杂志(电子版)

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2018, Vol. 12 ›› Issue (02) : 76 -82. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2018.02.002

所属专题： 文献；

基础研究

白色念珠菌烯醇化酶诱导产生中性粒细胞外网
孙路萍1, 章小缓1, 杨锦鸿1, 刘杨澜1, 欧玉雪1, 胡雁1,†()   
  1. 1. 510055　广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室
  • 收稿日期:2017-12-18 出版日期:2018-04-01
  • 通信作者: 胡雁
  • 基金资助:
    国家自然科学基金(81170969); 广东省医学科学技术研究基金(A2016026)

Recombinant enolase of Candida albicans could induce the formation of neutrophil extracellular traps

Luping Sun1, Xiaohuan Zhang1, Jinhong Yang1, Yanglan Liu1, Yuxue Ou1, Yan Hu1,†()   

  1. 1. Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, China
  • Received:2017-12-18 Published:2018-04-01
  • Corresponding author: Yan Hu
  • About author:
    Corresponding author:Hu Yan,Email:
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引用本文：

孙路萍, 章小缓, 杨锦鸿, 刘杨澜, 欧玉雪, 胡雁. 白色念珠菌烯醇化酶诱导产生中性粒细胞外网[J]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2018, 12(02): 76-82.

Luping Sun, Xiaohuan Zhang, Jinhong Yang, Yanglan Liu, Yuxue Ou, Yan Hu. Recombinant enolase of Candida albicans could induce the formation of neutrophil extracellular traps[J]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2018, 12(02): 76-82.

目的

通过重组白色念珠菌烯醇化酶（enolase），研究其对人中性粒细胞的作用。

方法

采用分子克隆法，构建质粒、克隆、表达、纯化白色念珠菌重组enolase，密度梯度离心法提取人中性粒细胞，通过2，7-二氯二氢荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）法、Sytox green染色和免疫荧光观察白色念珠菌重组enolase（500 nmol/L）对人中性粒细胞的刺激作用。中性粒细胞加入白色念珠菌SC5314（中性粒细胞∶白色念珠菌= 5∶1）作为阳性对照组（SC5314组），未加刺激的作为阴性对照组。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）及Tukey′s检验对数据进行统计分析。

结果

成功得到重组enolase，分子量为46 kDa。重组enolase可以刺激人中性粒细胞产生细胞内活性氧（ROS），enolase组与SC5314组产生ROS的量均无明显差异。Sytox green对胞外DNA定量及免疫荧光观察，均显示重组enolase可以刺激人中性粒细胞产生中性粒细胞外网（NETs）。NETs定量结果显示，enolase组[（11.0 ± 2.5）%]与SC5314组[（12.4 ± 2.0）%]在2 h时无明显差异（F = 6.13，P = 0.0886），在4 h时enolase组[（22.2 ± 2.0）%]显著低于SC5314组[（31.4 ± 3.1）%]，差异有统计学意义（F = 9.745，P = 0.0370）。

结论

白色念珠菌enolase可以诱导人中性粒细胞形成NETs。

关键词: 烯醇化酶, 念珠菌，白色, 中性白细胞, 外网
Objective

To investigate the effect of enolase of Candida albicans (C.albicans) on human neutrophils.

Methods

Molecular cloning method was applied to plasmids construcion, cloning, expression and recombinant enolase purification, and density gradient centrifugation was used to isolate the human neutrophils. The effects of recombinant enolase on human neutrophils were observed by DCFH-DA method, SYTOX green and immunofluorescence. The positive control (SC5314 group) was neutrophils stimulated by C.albicans SC5314 (neitrophil∶C.albicans = 5∶1) and the negative control was neutrophils without stimulation. One-Way ANOVA and Tukey′s test were applied for statistical analysis.

Results

Recombinant enolase, 46 kDa, was successfully cloned and purified. Recombinant enolase could stimulate neutrophils to produce the intracellular ROS, which has no significant difference compared with those induced by C.albicans SC5314 group at 30, 60 and 120 min. Sytox green quantitative and immunoflu-orescence observation of extracellular DNA showed that recombinant enolase also could induce human neutrophils to form NETs. NETs quantitative results showed that there was no significant difference between SC5314 group[ (12.41 ± 2.00) %] and enolase group[ (11.0 ± 2.5) %] at 2 h (F = 6.13, P= 0.0886) , but enolase group[ (22.2 ± 2.0) %) ]was significant lower than SC5314 group [ (31.4 ± 3.1) %] at 4 h (F = 9.745, P = 0.0370) .

Conclusion

Recombinant enolase of C.albicans could induce human neu-trophils to form NETs.

Key words: Enolase, Candida albicans, Neutrophils, Extracellular traps
图1 异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达重组烯醇化酶（enolase）
图2 镍柱层析法纯化重组烯醇化酶（enolase）
图3 烯醇化酶（enolase）诱导中性粒细胞产生活性氧（ROS）
图4 烯醇化酶（enolase）诱导DNA释放
图5 免疫荧光显微镜观察4 h中性粒细胞外网（NETs）形成（高倍放大）
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