白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2018.01.004

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2018, Vol. 12 ›› Issue (01) : 19 -25. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2018.01.004

所属专题：文献；

基础研究

白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

陈倩莹¹, 高雳¹, 王盼盼¹, 张驰¹, 李希庭¹, 赵川江^,¹

^1. 510055　广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室

收稿日期:2017-09-28 出版日期:2018-02-01
通信作者: 赵川江
基金资助:
广东省科技计划(2016A020215178); 广东省科技发展专项资金(2016A030310214)

The effect of interleukin-22 on the expression of RANKL and OPG in human periodontal ligament fibroblasts

Qianying Chen¹, Li Gao¹, Panpan Wang¹, Chi Zhang¹, Xiting Li¹, Chuanjiang Zhao^,¹

^1. Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, China

Received:2017-09-28 Published:2018-02-01
Corresponding author: Chuanjiang Zhao
About author:
Corresponding author:Zhao Chuanjiang,Email:zhaochj@mail.sysu.edu.cn

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引用本文：

陈倩莹, 高雳, 王盼盼, 张驰, 李希庭, 赵川江. 白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2018, 12(01): 19-25.

Qianying Chen, Li Gao, Panpan Wang, Chi Zhang, Xiting Li, Chuanjiang Zhao. The effect of interleukin-22 on the expression of RANKL and OPG in human periodontal ligament fibroblasts[J/OL]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2018, 12(01): 19-25.

目的

探讨白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）表达核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）的影响；并进一步研究IL-22是否与牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）具有协同刺激作用。

方法

酶消化法结合组织块法原代培养hPDLF，免疫细胞化学染色法鉴定其来源；取第3~ 5代细胞给予不同浓度（0、5、10、25、50、100 ng/mL）IL-22刺激，培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞毒性实验；采用5、10、25 ng/mL IL-22作用于hPDLF 72 h，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测RANKL、OPG mRNA的表达；随后选择最佳刺激浓度10 ng/mL IL-22，与1 μg/mL Pg-LPS分别或协同刺激hPDLF 72 h，实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RANKL、OPG mRNA和蛋白水平的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。

结果

50、100 ng/mL IL-22刺激hPDLF后，细胞活力明显下降（F_{24 h}= 15.17，F_{48 h}= 76.37，F_{72 h}= 24.409，P<0.05）；5、10、25 ng/mL IL-22均可上调hPDLF RANKL mRNA表达（F= 32.88，P<0.05），但是对OPG mRNA表达无明显影响（F= 0.719，P= 0.555）；10 ng/mL组和25 ng/mL组上调RANKL mRNA表达较5 ng/mL组显著（P<0.05）；1 μg/mL Pg-LPS亦可显著上调hPDLF RANKL mRNA和蛋白水平的表达；而10 ng/mL IL-22与1 μg/mL Pg-LPS协同作用下RANKL mRNA和蛋白表达可进一步显著上调（F_mRNA= 36.67，F_蛋白= 41.24，P<0.05），但是对OPG的表达无明显影响（F_mRNA= 0.652，P= 0.593；F_蛋白= 1.271，P= 0.313）。

结论

IL-22可通过影响hPDLF表达RANKL/OPG参与牙周炎骨破坏，并且与Pg-LPS具有协同作用。

关键词: 白细胞介素22, 牙龈卟啉单胞菌, 脂多糖类, 核因子κB受体活化因子, 配体, 骨保护素

Objective

To investigate the effect of interleukin-22 (IL-22) on the expression of RANKL and OPG in human periodontal ligament fibroblasts (hPDLFs) , and further explore the synergistic effect of IL-22 and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS) .

Methods

Primary hPDLFs were cultured using combined methods of tissue explant and enzymatic digestion, then identified by immunocytochemical staining. Passage third-fifth cells were treated with different concentrations of IL-22 (0~ 100 ng/mL) , and cell counting kit-8 (CCK-8) assay was used to detect the cytotoxicity at 24, 48, 72 h. 5, 10, 25 ng/mL IL-22 were applied to hPDLFs, and the expression of RANKL and OPG mRNA were assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) at 72 h. Furthermore, cells were treated with 1 μg/mL Pg-LPS alone, or together with 10 ng/mL IL-22 for 72 h. The expression of RANKL and OPG mRNA and their coding proteins were measured using qRT-PCR and Western blot. Data were evaluated by One-Way ANOVA.

Results

The 50 ng/mL and 100 ng/mL IL-22 significantly decreased cell viability of hPDLFs, comparing to the control group (F_{24 h}= 15.17, F_{48 h}= 76.37, F_{72 h}= 24.409, P<0.05) . A number of concentrations of IL-22 (5, 10 and 25 ng/mL) up-regulated the mRNA expression of RANKL in hPDLFs (F= 32.88, P<0.05) , with 10, 25 ng/mL more significantly than 5 ng/mL (P<0.05) . However, the mRNA expression of OPG was not affected (F= 0.719, P= 0.555) . Co-stimulation with 10 ng/mL IL-22 and 1 μg/mL Pg-LPS enhanced both RANKL mRNA and protein expression comparing with those of IL-22 or Pg-LPS stimulation alone (F_mRNA= 36.67, F_protein= 41.24, P<0.05) . OPG mRNA and protein were not changed compared with the control (F_mRNA= 0.652, P= 0.593; F_protein= 1.271, P= 0.313) .

Conclusions

IL-22 up-regulates RANKL expression in hPDLFs, and has synergistic effect with Pg-LPS, suggesting that IL-22 may participate in periodontal bone destruction.

Key words: Interleukin-22, Porphyromonas gingivalis, Lipopolysaccharides, Receptor activa-tor of nuclear factor-kappa B, Ligands, Osteoprotegerin

表1 实时荧光定量聚合酶链反应合成引物序列

基因名称	引物序列
β-actin	F:5′-TGGGACGACATGGAGAAA-3′
?	R:5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′
RANKL	F:5′-GCCAAGATCTCCAACATGAC-3′
?	R:5′-GTGCTTCCTCCTTTCATCAG-3′
OPG	F:5′-CAACACAGCTCACAAGAACA-3′
?	R:5′-CCCACTTTCTTTCCCGGTAA-3′

表1 实时荧光定量聚合酶链反应合成引物序列

基因名称	引物序列
β-actin	F:5′-TGGGACGACATGGAGAAA-3′
?	R:5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′
RANKL	F:5′-GCCAAGATCTCCAACATGAC-3′
?	R:5′-GTGCTTCCTCCTTTCATCAG-3′
OPG	F:5′-CAACACAGCTCACAAGAACA-3′
?	R:5′-CCCACTTTCTTTCCCGGTAA-3′

图2 人牙周膜成纤维细胞免疫组化染色结果　图2A为人牙周膜成纤维细胞抗波形丝蛋白染色阳性，细胞浆呈棕黄色；图2B为人牙周膜成纤维细胞抗角蛋白染色阴性，细胞浆不着色

表2 不同浓度白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）的毒性影响（%， ± s）

组别	样本量	相对细胞活力
组别	样本量	24 h	48 h	72 h
5 ng/mL IL-22组	4	93.92 ± 2.51	96.45 ± 1.75	91.30 ± 3.68
10 ng/mL IL-22组	4	95.61 ± 3.63	96.47 ± 2.33	89.39 ± 5.73
25 ng/mL IL-22组	4	89.98 ± 2.75	92.38 ± 0.71	89.49 ± 6.78
50 ng/mL IL-22组	4	90.51 ± 3.24	80.51 ± 3.63	73.21 ± 7.05
100 ng/mL IL-22组	4	65.72 ± 4.53	47.25 ± 3.01	28.83 ± 4.82

表2 不同浓度白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）的毒性影响（%， ± s）

组别	样本量	相对细胞活力
组别	样本量	24 h	48 h	72 h
5 ng/mL IL-22组	4	93.92 ± 2.51	96.45 ± 1.75	91.30 ± 3.68
10 ng/mL IL-22组	4	95.61 ± 3.63	96.47 ± 2.33	89.39 ± 5.73
25 ng/mL IL-22组	4	89.98 ± 2.75	92.38 ± 0.71	89.49 ± 6.78
50 ng/mL IL-22组	4	90.51 ± 3.24	80.51 ± 3.63	73.21 ± 7.05
100 ng/mL IL-22组	4	65.72 ± 4.53	47.25 ± 3.01	28.83 ± 4.82

图3 不同浓度白细胞介素22（IL-22）处理人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）后各组相对细胞活力统计图

图4 白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）mRNA表达的影响

图5 白细胞介素22（IL-22）、牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）协同对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）mRNA表达的影响

图6 白细胞介素22（IL-22）、牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）协同刺激对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）蛋白表达的影响

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