粪肠球菌生物膜的药物敏感性研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2011.03.002

目的

建立体外粪肠球菌生物膜模型，评价10%氢氧化钙溶液和2%洗必泰溶液去除粪肠球菌生物膜的效果。

方法

在玻片上形成4、8、12、24、48 h 粪肠球菌生物膜，荧光染色后，采用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察；用10%氢氧化钙溶液和2%洗必泰溶液分别处理24 h 生物膜3、10、30 min，采用CLSM 观察；ANOVA 方法进行统计分析。

结果

粪肠球菌生物膜具有空间立体结构，在48 h 内各时段生物膜中的活菌百分比由内向外逐渐增加；2%洗必泰溶液对粪肠球菌生物膜即时（3 min）杀菌效果优于10%氢氧化钙溶液，随着时间延长，氢氧化钙溶液杀菌效果同洗必泰溶液。

结论

粪肠球菌生物膜能形成三维立体空间结构，具有多样、不均质、开放的特点，在48 h 内各时段生物膜中的活菌百分比由内向外逐渐增加；10%氢氧化钙溶液和2%洗必泰溶液分别作用于24 h 粪肠球菌生物膜30 min，能灭活生物膜中的大部分细菌。

关键词: 粪肠球菌, 生物膜, 激光共聚焦扫描显微镜, 药物控制

Objective

To observe the structure of Enterococcus faecalis （E.faecalis）biofilm by an experimental biofilm model in vitro.To observe the susceptibility of 24-hour E.faecalis biofilm to calcium hydroxide and chlorhexidine and estimate the efficacy of two medications against E.faecalis biofilms.

Methods

E.faecalis biofilms were formed on glass slices at 4 h， 8 h， 12 h， 24 h and 48 h， respectively.E.faecalis biofilms formed on glass slices at 24 h were cultured with 10% calcium hydroxide and 2% chlorhexidine for 3 min， 10 min or 30 min.Biofilms observed by CLSM.The data were analyzed with One-Way ANOVA.

Results

It was shown that E.faecalis biofilm had three-dimensional spatial structure with various forms.As for the biofilms within 48 h， the percentage of vital bacteria increased from the inner layer to the outer.Chlorhexidine was more effective than calcium hydroxide against E.faecalis biofilm at 3 min， but there were no significant difference between calcium hydroxide and chlorhexidine after 10 min.

Conclusions

E.faecalis biofilm had a certain degree of thickness.Its structure was three dimensioned， heterogeneous， openning and of various forms.When E.faecalis biofilms were exposed to 10% calcium hydroxide and 2% chlorhexidine for 30 min， most of the bacteria were killed.

Key words: Enterococcus faecalis, Biofilm, Confocal laser scanning microscope, Drug control

图1 各时段粪肠球菌生物膜的平均厚度生物膜有一定厚度，形成速度很快，4 h 时平均厚度达到20.13 μm，12 h 达40.42 μm，随着时间的延长，生物膜无明显增加，24 h 时的平均厚度最大，48 h 时厚度下降

图2 粪肠球菌生物膜CLSM 观察图像（×200）生物膜中细菌分别被染成绿色（活细菌）和红色（死细菌），桔黄色（死菌和活菌重叠），细胞间有一些呈管状或泡状未被染色的黑暗区域

图3 粪肠球菌生物膜CLSM 三维立体图像（×200）图片内箭头所指为生物膜的外层，4 h 生物膜形成一定厚度，细胞层中散在许多小的细菌，活菌比例较低，12 h、24 h 生物膜中细菌密集，活菌比例相对较高，管道增多变粗，48 h 生物膜细菌仍很致密，死菌比例增高

图4 内层、中间层、外层平均活菌百分比粪肠球菌生物膜中细菌空间分布不均匀，48 h 内各时段的活菌百分比由内向外逐渐增加。内层细菌较致密，主要由死菌组成，活菌百分比从4 h 到24 h 逐渐升高，随着时间延长又逐渐降低；中间层细菌密集，活菌与死菌掺杂，各时段的活菌百分比为50% ～70%，较稳定；外层细菌总量明显较少，多为活菌，只有少量死菌分散其中，活菌百分比均高于60%，12 h 和24 h 高达80%以上

表1 氢氧化钙、洗必泰作用3 min 后24 h 生物膜平均活菌百分比（n=6，±s）

组别	生物膜活菌百分比（%）
组别	内层	中层	外层
对照	37.84 ± 2.64	56.48 ± 6.57	77.70 ± 2.77
氢氧化钙
3 min	32.26 ± 3.56	50.20 ± 8.52	60.11 ± 2.89^a
10 min	18.17 ± 4.88^a	22.20 ± 3.32^a	27.11 ± 4.34^a
30 min	10.06 ± 2.40^a	11.08 ± 3.90^a	7.32 ± 2.64^a
洗必泰
3 min	25.58 ± 2.83^ab	38.55 ± 7.69^a	52.44 ± 6.40^a
10 min	15.66 ± 2.43^a	19.53 ± 1.88^a	25.21 ± 4.72^a
30 min	8.43 ± 2.17^a	10.06 ± 3.30^a	6.34 ± 2.52^a

表1 氢氧化钙、洗必泰作用3 min 后24 h 生物膜平均活菌百分比（n=6，±s）

组别	生物膜活菌百分比（%）
组别	内层	中层	外层
对照	37.84 ± 2.64	56.48 ± 6.57	77.70 ± 2.77
氢氧化钙
3 min	32.26 ± 3.56	50.20 ± 8.52	60.11 ± 2.89^a
10 min	18.17 ± 4.88^a	22.20 ± 3.32^a	27.11 ± 4.34^a
30 min	10.06 ± 2.40^a	11.08 ± 3.90^a	7.32 ± 2.64^a
洗必泰
3 min	25.58 ± 2.83^ab	38.55 ± 7.69^a	52.44 ± 6.40^a
10 min	15.66 ± 2.43^a	19.53 ± 1.88^a	25.21 ± 4.72^a
30 min	8.43 ± 2.17^a	10.06 ± 3.30^a	6.34 ± 2.52^a

图5 10%氢氧化钙溶液作用粪肠球菌生物膜后三维重建图像（×200） A：正常生物膜中细菌致密，死菌较少；B：氢氧化钙溶液作用生物膜3 min 后，生物膜中死菌与活菌数量无明显变化；C：氢氧化钙溶液作用生物膜10 min 后，生物膜中细菌整体数量开始减少，活菌明显减少，死菌比例增加；D：氢氧化钙溶液作用生物膜30 min 后，生物膜中细菌整体数量明显减少，大部分为死菌，只存在少量活菌

图6 2%洗必泰溶液作用粪肠球菌生物膜后三维重建图像（×200） A：正常生物膜中细菌致密，死菌较少；B：洗必泰溶液作用生物膜3 min 后，生物膜中细菌整体数量无明显变化，死菌多于活菌；C：洗必泰溶液作用生物膜10 min 后，生物膜中细菌整体数量开始减少，活菌明显减少，死菌进一步增加；D：洗必泰溶液作用生物膜30 min 后，生物膜中细菌整体数量明显减少，几乎全为死菌，只存在极少活菌

1	Ferrari PH， Cai S， Bombana AC.Effect of endodo ntic procedures on enterococci， enteric bacteria and yeasts in primary endodontic infections.Int Endod J， 2005，38（6）：372-380.
2	Sundqvist G， Figdor D， Persson S， et al.Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 1998，85（1）：86-93.
3	Stevens RH， Porras OD， Delisle AL.Bacteriophages induced from lysogenic root canal isolates of Enterococcus faecalis.Oral Microbiol Immunol， 2009，24（4）：278-284.
4	Harrison AJ， Chivatxaranukul P， Parashos P， et al.The effect of ultrasonically activated irrigation on reduction of Enterococcus faecalis in experimentally infected root canals.Int Endod J， 2010，43（11）：968-977.
5	Shen Y， Qian W， Chung C， et al.Evaluation of the effect of two chlorhexidine preparations on biofilm bacteria in vitro： a threedimensional quantitative analysis.J Endod， 2009，35（7）：981-985.
6	Hope CK， Garton SG， Wang Q， et al.A direct comparison between extracted tooth and filter-membrane biofilm models of endodontic irrigation using Enterococcus faecalis.Arch Microbiol， 2010，192（9）：775-781.
7	Lima KC， Fava LR， Siqueira JF Jr.Susceptibilities of Enterococcus faecalis biofilms to someantimicrobial medications.J Endod， 2001，27（10）：616-619.
8	唐子圣，朱敏，刘正.变异链球菌生物膜结构观察.中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24（2）：103-106.
9	王旭，王英，范晓敏，等.强酸性电解质水对粪肠球菌生物膜杀菌作用的体外研究.牙体牙髓牙周病学杂志， 2010，20（5）：263-267，284.
10	凌均棨.根尖周病治疗学.北京：人民卫生出版社，2005：143-146.
11	Chivatxaranukul P， Dashper SG， Messer HH.Dentinal tubule invasion and adherence by Enterococcus faecalis.Int Endod J， 2008，41（10）：873-882.
12	Sena NT， Gomes BP， Vianna ME， et al.In vitro antimicrobial activity of sodium hypochlorite and chlorhexidine against selected singlespecies biofilms.Int Endod J， 2006，39（11）：878-885.
13	de Fúcio SB， Puppin-Rontani RM， de Carvalho FG， et al.Analyses of biofilms accumulated on dental restorative materials.Am J Dent，2009，22（3）：131-136.
14	Portenier I， Waltimo T， Ørstavik D， et al.The susceptibilities of starved stationary phase， and growing cells of Enterococcus faecalis to endodontic medications.J Endod， 2005，31（5）：380-386.
15	Hews RS， Gulabivak K， Nq YL， et al.An in vitro evalution of the ability of ozone to kill a strain of Enterococcus faecalis.Int Endod J，2005，38（1）：22-29.
16	周泽渊，倪龙兴，吴补领，等.用激光共聚焦显微镜研究菌斑生物膜的结构.牙体牙髓牙周病学杂志， 2001，11（3）：152-153.
17	李楠.激光扫描共聚焦显微术.北京：人民军医出版社， 1997：5-32.
18	Rozen R， Bachrach G， Zachs B， et al.Growth rate and biofilm thickness of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans on hydroxapatite.APMIS， 2001，109（2）：155-160.
19	Brändle N， Zehnder M， Weiger R， et al.Impact of growth conditions on susceptibility of five microbial species to alkaline stress.J Endod，2008，34（5）：579-582.
20	Shen Y， Qian W， Chung C， et al.Evaluation of the effect of two chlorhexidine preparations on biofilm bacteria in vitro： a threedimensional quantitative analysis.J Endod， 2009，35（7）：981-985.
21	Athanassiadis B， Abbott PV， George N， et al.An in vitro study of the antimicrobial activity of some endodontic medicaments against Enteroccus faecalis biofilms.Aust Dent J， 2010，55（2）：150-155.
22	Evans M， Davies JK， Sundqvist G， et al.Mechanisms involved in the resistance of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide.Int Endod J， 2002，35（3）：221-228.
23	Gomes BP， Vianna ME， Matsumoto CU， et al.Disinfection of gutta-percha cones with chlorhexidine and sodium hypochlorite.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2005，100（4）：512-517.
24	Basrani B， Santos JM， Tjäderhane L.Substantive antimicrobial activity in chlorhexidine-treated human root dentin.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2002，94（2）：240-245.

[1]	杨友涵, 文印宪, 陈廖斌. 噬菌体用于关节假体周围感染治疗的研究进展[J/OL]. 中华关节外科杂志(电子版), 2024, 18(01): 125-130.
[2]	李小兵. 伤口细菌生物膜的影响和处理[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2020, 15(05): 422-422.
[3]	孙瑞朋, 孙静, 赵连魁, 李东军, 怀乔, 徐丽娟. 改性甲壳素生物修复膜治疗浅Ⅱ度烧伤的临床疗效[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2019, 14(04): 280-284.
[4]	张利, 张阳, 马菁菁, 喻哲昊, 葛亮, 孙林春. 细胞壁锚定蛋白SasX调控RNAⅢ参与金黄色葡萄球菌ST239克隆生物膜形成及致病性相关研究[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(04): 252-259.
[5]	卢铭浩, 李红, 侯本祥. 根尖生物膜清除方法的研究进展[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2024, 18(04): 257-261.
[6]	张延清, 冯少霞, 陈宇. 乳酸乳球菌对致龋菌生长及生物膜形成的作用[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2024, 18(02): 96-102.
[7]	姚丽萍, 张蕾, 林玉红, 张梦晗, 卢志山. 纳米银溶液用于慢性根尖周炎根管内封药的实验动物研究[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2020, 14(02): 95-100.
[8]	马皓祯, 李晓岚. 器官型口腔黏膜感染模型在宿主-微生物关系研究的应用与展望[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2019, 13(06): 321-327.
[9]	方道成, 陈立新, 胡媛媛. 输尿管支架结壳的相关研究进展[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2024, 18(04): 402-405.
[10]	李重, 陈飞, 王洪伟. 粪肠球菌预测结直肠癌复发的研究[J/OL]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2021, 10(01): 81-85.
[11]	董行, 郎东浩, 符雪, 李芳, 王凌峰. 群体感应系统与生物膜耐药机制的研究现状[J/OL]. 中华临床医师杂志(电子版), 2021, 15(01): 57-60.
[12]	孙丹, 姬会春, 祝宇翀, 单宇, 刘军权, 廖雨琴. 三叶青提取物TH-w3对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制和清除作用[J/OL]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2022, 10(04): 227-232.
[13]	李倩珺, 黄淑洪, 雷毅怡, 冯泳琳. 黄连对生物膜状态下耐氟康唑白色念珠菌凝集素样序列基因表达影响[J/OL]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2022, 10(02): 89-94.
[14]	麦杏连, 刘思瑶, 陈旋, 何倩君, 张中文, 钟国权, 温伟洪, 徐令清. 尿路感染粪肠球菌耐药性与耐药基因相关性研究[J/OL]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2021, 09(02): 65-70.
[15]	杨锐富, 周燕斌. 主要协同转运蛋白超家族膜转运蛋白与细菌生物膜形成的相关性研究进展[J/OL]. 中华诊断学电子杂志, 2023, 11(02): 77-81.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Susceptibility of Enterococcus faecalis biofilm in vitro

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Susceptibility of Enterococcus faecalis biofilm in vitro