乳酸乳球菌对致龋菌生长及生物膜形成的作用

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2024.02.004

目的

研究乳酸乳球菌（Ll）对4种致龋菌生长及生物膜形成的影响，为Ll龋病防治提供基础。

方法

厌氧条件下培养Ll、变异链球菌（Sm）、内氏放线菌（An）、黏放线菌（Av）和嗜酸乳杆菌（La），琼脂扩散实验检测Ll对4种致龋菌的抑菌圈直径（IZD）；琼脂板竞争实验检测Ll与4种致龋菌的拮抗相互作用；4种致龋菌单独培养生物膜为单独培养组，Ll分别与其共培养生物膜为共培养组，结晶紫染色法（CVS）及扫描电镜（SEM）检测Ll对4种致龋菌生物膜形成的影响。采用SPSS 20.0统计软件数据分析。Ll对4种致龋菌的IZD整体分析采用单因素方差分析，Tukey′s HSD检验进行组间多重比较，采用Student′s t检验对细菌生物膜量进行比较。

结果

琼脂扩散实验结果显示，Ll对4种致龋菌均表现出一定的抑制作用。Ll对An的IZD最大，为（11.97 ± 0.40）mm，对Sm的IZD最小，为（4.67 ± 0.32）mm。Ll对4种致龋菌的IZD两两比较，差异有统计学意义（F = 241.22，P<0.001）。琼脂板竞争实验显示，Ll对La、An、Av表现为竞争性抑制作用；CVS结果显示，Ll与Sm、An共培养形成的双菌种生物膜的生物膜量分别为（30.66 ± 0.48）、（10.27 ± 0.04），Sm、An单独培养形成的单菌种生物膜的生物膜量分别为（80.26 ± 2.55）、（73.98 ± 0.35），Sm、An双菌种生物膜的生物膜量与单菌种生物膜的生物膜量比较差异有统计学意义（t_Sm = 19.090，P_Sm<0.001，t_An = 183.3，P_An<0.001）。SEM结果显示，Ll与Sm或An共培养形成的双菌种生物膜明显变薄。

结论

Ll可抑制Sm、An、Av和La生长，并减少Sm、An生物膜的形成。

关键词: 有益菌种, 乳酸乳球菌, 生物膜, 致病菌

Objective

To study the effects of Lactococcus lactis (Ll) on the growth and biofilm formation of 4 kinds of cariogenic bacteria, and to provide the basis for the application in caries prevention and control.

Methods

Ll, Streptococcus mutans (Sm) , Actinomyces naeslundii (An) , Actinomyces viscosus (Av) and Lactobacillus acidophilus (La) were cultured under anaerobic conditions. A spot-on-lawn assay was used to evaluate the inhibition of Ll for these 4 kinds of cariogenic bacteria. The antagonistic interaction between Ll and these cariogenic bacteria was detected by plate competition test. The four kinds of cariogenic bacteria cultured separately were the single-cultured group, Ll co-cultured with 4 cariogenic bacteria separately were the co-cultured group. Crystal violet staining (CVS) and scanning electron microscopy (SEM) was used to evaluate the effect of Ll on the biofilm formation of the 4 kinds of cariogenic bacteria. SPSS 20.0 statistical software was used for data analysis. The data from the measurement of the inhibitory-zone diameters (IZD) of Ll against the 4 kinds of cariogenic bacteria were compared and statistically analyzed with One-Way analysis of variance (ANOVA) and tukey′s HSD test, and the amount of bacterial biofilm was compared by Student′s t test.

Results

Spot-on-lawn assay showed that Ll inhibited the growth of the 4 kinds of cariogenic bacteria. Ll had the largest IZD for An, (11.97 ± 0.40) mm, and the smallest for Sm, (4.67 ± 0.32) mm. Ll showed statistically significant difference in the IZD of the 4 kinds of cariogenic bacteria (F = 241.22, P<0.001) . The plate competition test showed that Ll showed competitive inhibition against La, An and Av. CVS showed that the biofilm quantity of Sm and An co-cultured with Ll was (30.66 ± 0.48) and (10.27 ± 0.04) , respectively. The biofilm quantity of Sm and An single-cultured was (80.26 ± 2.55) and (73.98 ± 0.35) , respectively. For Sm and An biofilm, there was statistical difference in the biofilm quantity between co-cultured and single-cultured groups (t_Sm = 19.090, P_Sm<0.001, t_An = 183.3, P_An<0.001) . The SEM showed that Sm and An showed significantly thinner biofilm in coexistence with Ll than in the absence of Ll.

Conclusion

Ll could inhibit the growth of Sm, An, Av, La, and reduce the formation of Sm, An biofilms.

Key words: Probiotics, Lactococcus lactis, Biofilm, Pathogens

图1 乳酸乳球菌（Ll）对致龋菌的抑菌效果　A：对变异链球菌（Sm）的抑菌圈；B：对内氏放线菌（An）的抑菌圈；C：对嗜酸乳杆菌（La）的抑菌圈；D：对黏放线菌（Av）的抑菌圈；内圈直径一致。

表1 乳酸乳球菌对致龋菌的抑菌圈直径（IZD）

菌株	来源	IZD（mm，±s）
内氏放线菌（An）	ATCC 12104	11.97 ± 0.40^a
嗜酸乳杆菌（La）	ATCC 4356	9.38 ± 0.48^b
黏放线菌（Av）	ATCC 15987	6.64 ± 0.14^c
变异链球菌（Sm）	UA 159	4.67 ± 0.32^d

表1 乳酸乳球菌对致龋菌的抑菌圈直径（IZD）

菌株	来源	IZD（mm，±s）
内氏放线菌（An）	ATCC 12104	11.97 ± 0.40^a
嗜酸乳杆菌（La）	ATCC 4356	9.38 ± 0.48^b
黏放线菌（Av）	ATCC 15987	6.64 ± 0.14^c
变异链球菌（Sm）	UA 159	4.67 ± 0.32^d

图2 乳酸乳球菌（Ll）与致龋菌之间的竞争相互作用　A：对变异链球菌（Sm）竞争性抑制；B：对黏放线菌（Av）竞争性抑制；C：对内氏放线菌（An）竞争性抑制；D：对嗜酸乳杆菌（La）竞争性抑制；左侧菌落均为Ll。

图3 致龋菌单独培养及共培养24 h生物膜的生物膜量（与单菌种组相比，^aP<0.05）　变异链球菌（Sm）或内氏放线菌（An）单独培养组生物膜量多于共培养组（P<0.05）。La为嗜酸乳杆菌；Av为黏放线菌。

图4 致龋菌单独培养及共培养24 h生物膜结晶紫染色结果　A ~ D：左侧为嗜酸乳杆菌（La）、变异链球菌（Sm）、黏放线菌（Av）、内氏放线菌（An）单独培养组，右侧为共培养组。

表2 致龋菌单独培养及共培养24 h生物膜的生物膜量（

±s，×100）

组别	嗜酸乳杆菌	变异链球菌	黏放线菌	内氏放线菌
单独培养组	10.07 ± 0.24	80.26 ± 2.55	11.72 ± 0.25	73.98 ± 0.35
共培养组	10.86 ± 0.41	30.66 ± 0.48	11.56 ± 0.13	10.27 ± 0.04
t值	1.656	19.090	0.551	183.3
P值	0.173	<0.001	0.611	<0.001

表2 致龋菌单独培养及共培养24 h生物膜的生物膜量（

±s，×100）

组别	嗜酸乳杆菌	变异链球菌	黏放线菌	内氏放线菌
单独培养组	10.07 ± 0.24	80.26 ± 2.55	11.72 ± 0.25	73.98 ± 0.35
共培养组	10.86 ± 0.41	30.66 ± 0.48	11.56 ± 0.13	10.27 ± 0.04
t值	1.656	19.090	0.551	183.3
P值	0.173	<0.001	0.611	<0.001

图5 扫描电镜观察乳酸乳球菌（Ll）24 h生物膜表面形态　Ll单独培养24 h未见明显生物膜形成。

图6 扫描电镜观察致龋菌单独培养及共培养生物膜表面形态　A ~ D：分别为变异链球菌（Sm）、嗜酸乳杆菌（La）、黏放线菌（Av）及内氏放线菌（An）单独培养组；E ~ H：分别为Sm、La、Av及An与乳酸乳球菌（Ll）共培养组。

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