神经-肿瘤相互作用对腺样囊性癌细胞侵袭、生存能力及基因表达的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2014.01.002

目的

探讨神经微环境对腺样囊性癌（ACC）细胞侵袭、生存能力及基因表达的影响。

方法

通过免疫组织化学、ACC 嗜神经侵袭体外模型、结合基因芯片技术，对临床病理标本及肿瘤细胞进行研究。

结果

32 例ACC 中有25 例（78.1%）发生了嗜神经侵袭，其中实性型与筛孔型的嗜神经发生率较管状型高（P=0.03）；神经组织与肿瘤细胞相互作用可以提高肿瘤细胞的生存能力、减少凋亡；通过基因芯片技术，在ACC-M 与神经相互作用过程中筛选出369 个表达上调的基因和920 个表达下调的基因，其中许多基因已经证实参与调节细胞生长、凋亡、运动以及黏附等重要的生物过程。

结论

本研究初步揭示了神经组织与ACC 细胞相互作用为肿瘤细胞提供了生存优势条件，为进一步对ACC 嗜神经侵袭机制的研究提供了部分参考。

关键词: 腺样囊性癌, 嗜神经侵袭, 基因芯片

Objective

To analyse the impact of neural microenvironment on invasion， survival and gene expression of adenoid cystic carcinoma （ACC） cells.

Methods

The immunohistochemical stain， ACC perineural invasion in vitro model， and Gene Chips were used to investigate the changing of invasion， survival ability and gene expression of ACC cells during the nerve-ACC cells interaction.

Results

PNI was identified in 25 of 32 ACC cases （78.1%）. The incidence of PNI was higher in solid and cribriform pattern of ACC. The nerve-ACC cells interaction could increase the survival ability and decrease the apoptotic activity of ACC cells. By GeneChips， we found 369 genes up-regulated and 920 genes down-regulated in the co-culture model.

Conclusion

The gene changing of ACC cell-nerve interaction might involve in the process of PNI.

Key words: Adenoid cystic carcinoma, Perineural invasion, Gene chips

表1 ACC 嗜神经侵袭现象与临床病理参数的关系

临床病理指标	例数	PNI（例）		P值
临床病理指标	例数	阳性	阴性	P值
年龄（岁）
＞50	15	14	1	0.051
＜50	17	11	6
性别
男	12	10	2	0.581
女	20	15	5
T分期
T1/2	19	13	6	0.195
T3/4	13	12	1
病理分型
筛孔型	14	13	1	0.003^a
管状型	11	5	6
实性型	7	7	0
发病部位
大唾液腺	14	12	2	0.426
小唾液腺	18	13	5

表1 ACC 嗜神经侵袭现象与临床病理参数的关系

临床病理指标	例数	PNI（例）		P值
临床病理指标	例数	阳性	阴性	P值
年龄（岁）
＞50	15	14	1	0.051
＜50	17	11	6
性别
男	12	10	2	0.581
女	20	15	5
T分期
T1/2	19	13	6	0.195
T3/4	13	12	1
病理分型
筛孔型	14	13	1	0.003^a
管状型	11	5	6
实性型	7	7	0
发病部位
大唾液腺	14	12	2	0.426
小唾液腺	18	13	5

图1 ACC 细胞侵袭神经的模式（ × 200）图1A 为ACC 细胞全部或部分包绕神经纤维；图1B 为ACC 细胞浸润到神经纤维内部；箭头示肿瘤细胞，棕黄色染色部位为S-100 蛋白标记之神经组织

图2 肿瘤细胞与小鼠背根神经节共培养上清可以间接增强肿瘤细胞的侵袭能力图2A 为ACC-M 在共培养上清刺激下的侵袭细胞（×400）；图2B 为ACC-M 在对照上清刺激下的侵袭细胞（×400）；ACC-M在共培养间接刺激下侵袭细胞较对照组明显增多；图2C 为ACC-M、ACC-2、Tca8113 三种细胞系在不同培养基刺激下的侵袭能力对比（t 检验）

图3 ACC 组织中远离神经与靠近神经的部位增殖能力与凋亡检测图3A 为神经周围肿瘤细胞的Ki-67 染色（×400）；图3B 为远离神经部位的肿瘤细胞的Ki-67 染色（×400）；图3C 为神经周围肿瘤细胞的凋亡活性检测（×200）；图3D 为远离神经部位的肿瘤细胞的凋亡活性检测（×200）；图3A、图3C 示在神经周围肿瘤细胞的增殖能力增强而凋亡减少；图3E 为在ACC 细胞（ACC-M、ACC-2）与小鼠背根神经节（DRG）的相互作用的间接刺激下，ACC 细胞的增殖能力显著增强；图3F 为凋亡显著减少（t 检验）

图4 神经组织对肿瘤细胞增殖活性的影响注:使用ACC 细胞与小鼠背根神经节（DRG）共培养上清可显著刺激ACC 细胞体外生长与增殖（MTT 试验）

表2 基因芯片分析条件培养基刺激ACC 细胞后的基因表达变化（部分）

基因符号	基因名称	通路	变化
SERPINE1	丝氨酸蛋白酶抑制剂E（连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂1）	凝血级联反应	上调
		TGF-β 信号通路
INHBA	抑制素，βA（活化素A，活化素ABα 多肽）	TGF-β 信号通路	上调
PTPRR	蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体11 型（努南综合征1）	-	上调
NF2	神经纤维素蛋白2（merlin）	-	上调
SSTR1	生长抑素受体1	G 蛋白偶联受体A	上调
		G 蛋白偶联受体
IL6	白细胞介素6（干扰素，β2）	平滑肌收缩	上调
THBS1	凝血酶敏感蛋白1	炎症反应通路，TGF-β 信号通路	上调
ICAM1	细胞间黏附分子1（CD54）	-	上调
DAPK1	死亡相关蛋白激酶	-	上调
SOCS2	细胞因子信号转导抑制蛋白2	-	上调
CD44	CD44 分子（Indian blood group）	-	上调
AMIGO2	Ig 样结构域黏附分子2	-	上调
TNFRSF12A	肿瘤坏死因子受体超家族，member 12A	-	上调
TPM4	原肌球蛋白4	横纹肌收缩	上调
HK2	己糖激酶2	糖酵解及糖异生	上调
NR4A2	细胞核受体亚家族4，group A，member 2	核受体	下调
IL18	白细胞介素18（干扰素γ 诱导因子）	-	下调
SNAP25	突触相关膜蛋白，25 kDa	-	下调
ITGB2	整联蛋白，β2（补体成分3 受体3 及4 亚单位）	整联蛋白介导的细胞黏附	下调
NEDD9	神经前体细胞表达、发育中下调9	-	下调
WISP2	WNT1 诱导信号通路蛋白2	-	下调
CDH5	钙黏蛋白5，type 2（血管内皮）	-	下调
NRP1	神经菌毛素1	-	下调
SEMA3B	神经生长抑制因子3B	-	下调
CASP9	半胱天冬酶9，凋亡相关半胱氨酸肽酶	凋亡	下调
		凋亡KEGG
CASP1	半胱天冬酶1，凋亡相关半胱氨酸肽酶（白细胞介素1，β，转化酶）	凋亡	下调
		凋亡KEGG
PRKCZ	蛋白激酶C，zeta	心脏细胞的钙调节G 蛋白信号	下调
ANXA4	膜联蛋白A4	前列腺素合成调节	下调
TGFBR2	转化生长因子β 受体Ⅱ（70 / 80 kDa）	TGF-β 信号通路	下调
IL10RB	白细胞介素10 受体，β	G 蛋白偶联受体信息系统	下调

表2 基因芯片分析条件培养基刺激ACC 细胞后的基因表达变化（部分）

基因符号	基因名称	通路	变化
SERPINE1	丝氨酸蛋白酶抑制剂E（连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂1）	凝血级联反应	上调
		TGF-β 信号通路
INHBA	抑制素，βA（活化素A，活化素ABα 多肽）	TGF-β 信号通路	上调
PTPRR	蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体11 型（努南综合征1）	-	上调
NF2	神经纤维素蛋白2（merlin）	-	上调
SSTR1	生长抑素受体1	G 蛋白偶联受体A	上调
		G 蛋白偶联受体
IL6	白细胞介素6（干扰素，β2）	平滑肌收缩	上调
THBS1	凝血酶敏感蛋白1	炎症反应通路，TGF-β 信号通路	上调
ICAM1	细胞间黏附分子1（CD54）	-	上调
DAPK1	死亡相关蛋白激酶	-	上调
SOCS2	细胞因子信号转导抑制蛋白2	-	上调
CD44	CD44 分子（Indian blood group）	-	上调
AMIGO2	Ig 样结构域黏附分子2	-	上调
TNFRSF12A	肿瘤坏死因子受体超家族，member 12A	-	上调
TPM4	原肌球蛋白4	横纹肌收缩	上调
HK2	己糖激酶2	糖酵解及糖异生	上调
NR4A2	细胞核受体亚家族4，group A，member 2	核受体	下调
IL18	白细胞介素18（干扰素γ 诱导因子）	-	下调
SNAP25	突触相关膜蛋白，25 kDa	-	下调
ITGB2	整联蛋白，β2（补体成分3 受体3 及4 亚单位）	整联蛋白介导的细胞黏附	下调
NEDD9	神经前体细胞表达、发育中下调9	-	下调
WISP2	WNT1 诱导信号通路蛋白2	-	下调
CDH5	钙黏蛋白5，type 2（血管内皮）	-	下调
NRP1	神经菌毛素1	-	下调
SEMA3B	神经生长抑制因子3B	-	下调
CASP9	半胱天冬酶9，凋亡相关半胱氨酸肽酶	凋亡	下调
		凋亡KEGG
CASP1	半胱天冬酶1，凋亡相关半胱氨酸肽酶（白细胞介素1，β，转化酶）	凋亡	下调
		凋亡KEGG
PRKCZ	蛋白激酶C，zeta	心脏细胞的钙调节G 蛋白信号	下调
ANXA4	膜联蛋白A4	前列腺素合成调节	下调
TGFBR2	转化生长因子β 受体Ⅱ（70 / 80 kDa）	TGF-β 信号通路	下调
IL10RB	白细胞介素10 受体，β	G 蛋白偶联受体信息系统	下调

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