靶向p38丝裂素活化蛋白激酶对兔唇裂术后瘢痕增生的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2023.01.005

目的

研究运用p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）基因重组腺病毒靶向敲低目的基因的表达，通过检测p38MAPK信号通路受到抑制后不同时间段兔上唇瘢痕增生受到的影响，来探讨疗效最佳的基因治疗时间。

方法

对90只2.0~2.5 kg的上唇裂新西兰白兔进行唇裂修复术，选取术后第0、1、2周对其瘢痕正中注射重组病毒，将第3周的瘢痕组织制成标本。通过使用蛋白免疫印迹法（Western blot）、实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学染色等方法分别定性、定量检测p38MAPK及瘢痕形成相关因子与Smad蛋白和mRNA的相对表达水平。使用SPSS 24.0软件对实验结果进行统计学分析。

结果

相较于术后第0、2周，术后第1周瘢痕组织中ColⅢ（1.373 ± 0.073，F = 8.027，P = 0.002）、MMP1（1.715 ± 0.028，F = 9.262，P = 0.001）表达明显升高，ColⅠ（0.424 ± 0.015，F = 7.794，P = 0.003）和TIMP1（0.464 ± 0.025，F = 6.196，P = 0.007）表达明显降低，差异均有统计学意义。术后第1周的Smad2蛋白表达水平与mRNA表达水平降低（F = 14.123，P = 0.029），Smad3蛋白表达水平与mRNA表达水平降低（F = 3.796，P = 0.037），与其他组相比差异均有统计学意义。

结论

抑制p38MAPK表达可能通过Smad依赖型信号通路发挥抑制瘢痕增生的作用，兔上唇唇裂术后第1周瘢痕形成过程中靶向敲低p38MAPK对瘢痕增生影响最大。

关键词: p38丝裂素活化蛋白激酶, 基因沉默, 腺病毒, 增生性瘢痕, 基因治疗

Objective

The recombinant adenovirus of p38 mitogen-activated protein kinases (p38MAPK) gene was used to knock down the expression of target genes. By detecting the influence of p38MAPK signal pathway obstruction on upper lip scar hyperplasia in different time periods, the optimal therapeutic time of gene therapy was determined.

Methods

A total of ninety New Zealand white rabbits with cleft upper lip of 2.0-2.5 kg were treated with cleft lip repair. Recombinant virus was injected into the scar center at week 0, 1 and 2 after surgery, and the scar tissue was made into specimens at week 3 after surgery. Western blot, Real-time fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemical staining were used to quantitatively and qualitatively detect the relative expression levels of proteins and mRNA of p38MAPK, scar formation related factors and Smad. The results of Western blot and RT-PCR were analyzed with software (SPSS v. 24.0) .

Results

The results of Western blot, RT-PCR and immunohistochemical staining showed that the expressions of Col Ⅲ (1.373 ± 0.073, F = 8.027, P = 0.002) and MMP1 (1.715 ± 0.028, F = 9.262, P = 0.001) in scar tissue of the injection group at week 1 after surgery were significantly higher than those at week 0 and 2. The expressions of ColⅠ (0.424 ± 0.015, F = 7.794, P = 0.003) and TIMP1 (0.464 ± 0.025, F = 6.196, P = 0.007) significantly decreased. The expression level of Smad protein and mRNA in the injection group at 1 week after surgery decreased, and the results were statistically significant compared with other groups (F_p-smad2 = 14.123, P_p-smad2 = 0.029; F_p-smad3 = 3.796, P_p-smad3 = 0.037) .

Conclusions

Inhibition of p38MAPK expression may play a role in inhibiting scar hyperplasia through the Smad dependent signaling pathway. Targeted p38MAPK knockdown had the greatest effect on scar hyperplasia at one week after cleft-lip surgery in rabbit upper lip.

Key words: p38 mitogen-activated protein kinases (p38MAPK), Gene silencing, Adenovirus, Hypertrophic scar, Gene therapy

表1 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测瘢痕形成相关因子的引物序列

基因	引物序列	产物长度（bp）
GAPDH	正向：5′-AAGGTCGGAGTGAACGGATTTG-3′	148
	反向：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGAAC-3′
ColⅠ	正向：5′-CAAGGGAGAGAGTGGTAACAAG-3′	92
	反向：5′-TTCCCACTTTCACCCTTGAC-3′
ColⅢ	正向：5′-CACTCGGACTTGCAGGAATTA-3′	109
	反向：5′-TTCCCACTTTCACCCTTGAC-3′
MMP1	正向：5′-GATGACAGGTGGACCAAAGAT-3′	102
	反向：5′-CCCAATATCAGTAGAATGGGAGAG-3′
TIMP1	正向：5′-CTACCTTGTACCAGCGTTATGA-3′	140
	反向：5′-GTTCTGGGATTTGTGGGAGTA-3′

表1 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测瘢痕形成相关因子的引物序列

基因	引物序列	产物长度（bp）
GAPDH	正向：5′-AAGGTCGGAGTGAACGGATTTG-3′	148
	反向：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGAAC-3′
ColⅠ	正向：5′-CAAGGGAGAGAGTGGTAACAAG-3′	92
	反向：5′-TTCCCACTTTCACCCTTGAC-3′
ColⅢ	正向：5′-CACTCGGACTTGCAGGAATTA-3′	109
	反向：5′-TTCCCACTTTCACCCTTGAC-3′
MMP1	正向：5′-GATGACAGGTGGACCAAAGAT-3′	102
	反向：5′-CCCAATATCAGTAGAATGGGAGAG-3′
TIMP1	正向：5′-CTACCTTGTACCAGCGTTATGA-3′	140
	反向：5′-GTTCTGGGATTTGTGGGAGTA-3′

表2 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测p38MAPK与Smad的引物序列

基因	引物序列	产物长度（bp）
GAPDH	正向：5′-AAGGTCGGAGTGAACGGATTTG-3′	148
	反向：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGAAC-3′
p38MAPK	正向：5′-CAAATCCTCCGAGGCCTAAA-3′	103
	反向：5′-GGATCTTCAGCTCACAGTCTTC-3′
Smad2	正向：5′-CCAGTTCTGCCTCCAGTATTAG-3′	91
	反向：5′-TTTCTGGAATGGAGTGGGTATAG-3′
Smad3	正向：5′-TACCTGAGCGAAGATGGAGAG-3′	119
	反向：5′-GGCTGCAGGTCCAAGTTATT-3′

表2 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测p38MAPK与Smad的引物序列

基因	引物序列	产物长度（bp）
GAPDH	正向：5′-AAGGTCGGAGTGAACGGATTTG-3′	148
	反向：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGAAC-3′
p38MAPK	正向：5′-CAAATCCTCCGAGGCCTAAA-3′	103
	反向：5′-GGATCTTCAGCTCACAGTCTTC-3′
Smad2	正向：5′-CCAGTTCTGCCTCCAGTATTAG-3′	91
	反向：5′-TTTCTGGAATGGAGTGGGTATAG-3′
Smad3	正向：5′-TACCTGAGCGAAGATGGAGAG-3′	119
	反向：5′-GGCTGCAGGTCCAAGTTATT-3′

图1 病毒注射后各组兔上唇瘢痕组织切片免疫组织化学染色结果（高倍放大）　瘢痕形成相关因子在染色切片中均被染为棕黄色，存在于细胞质，细胞核呈蓝色；ColⅠ：Ⅰ型胶原；ColⅢ：Ⅲ型胶原；MMP1：基质金属蛋白酶1；TIMP1：基质金属蛋白酶抑制剂1。

图2 蛋白免疫印迹（Western blot）检测各组兔上唇瘢痕组织内瘢痕形成相关因子的蛋白表达水平　A：蛋白相对表达水平量化统计图；B：Western blot结果；ColⅠ：Ⅰ型胶原；ColⅢ：Ⅲ型胶原；MMP1：基质金属蛋白酶1；TIMP1：基质金属蛋白酶抑制剂1；Mr：相对分子质量；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：术后2周组；4：术后1周组；5：术后0周组。

图3 蛋白免疫印迹（Western blot）检测兔上唇瘢痕组织内的Smad与p38MAPK的磷酸化蛋白表达水平　A：蛋白相对表达水平量化统计图；B：Western blot结果；p-Smad2：Smad2磷酸化蛋白；p-Smad3：Smad3磷酸化蛋白；p-p38MAPK：p38MAPK磷酸化蛋白；Mr：相对分子质量；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：术后1周组。

图4 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组兔上唇瘢痕组织内瘢痕形成相关因子mRNA水平表达情况　 ColⅠ：Ⅰ型胶原；ColⅢ：Ⅲ型胶原；MMP1：基质金属蛋白酶1；TIMP1：基质金属蛋白酶抑制剂1。

图5 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测兔上唇瘢痕组织内Smad与p38MAPK的mRNA水平表达情况　 p38MAPK：p38丝裂素活化蛋白激酶；Smad2、Smad3：TGF-β信号通路转导途径中的重要基因。

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Effect of targeting p38MAPK on scar hyperplasia after rabbit cleft lip repair in vivo

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