低强度脉冲式超声波在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分化中的抗炎和抗氧化作用

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2023.01.004

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2023, Vol. 17 ›› Issue (01) : 26 -36. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2023.01.004

论著

低强度脉冲式超声波在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分化中的抗炎和抗氧化作用

尹娟¹, 杨兴², 李平¹, 徐旻馨³, 鲍玉³, 张志鹏³, 薛慧³^,^†(

)

^1. 南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院中心实验室，苏州　215008
^2. 南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院骨科，苏州　215008
^3. 南京医科大学姑苏学院，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院口腔科，苏州　215008

收稿日期:2022-08-22 出版日期:2023-02-01
通信作者: 薛慧

The mechanism of anti-inflammatory and antioxidant effects of low-intensity pulsed ultrasound on lipopolysaccharide-induced RAW264.7 macrophage differentiation

Juan Yin¹, Xing Yang², Ping Li¹, Minxin Xu³, Yu Bao³, Zhipeng Zhang³, Hui Xue³^,^†()

^1. Central Laboratory, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China
^2. Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China
^3. Department of Stomatology, Suzhou Municipal Hospital, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Gusu School, Nanjing Medical University, Suzhou 215008, China

Received:2022-08-22 Published:2023-02-01
Corresponding author: Hui Xue
Supported by:
Science and Technology Planning Project of Jiangsu Province(BE2022737); Science and Technology Development of Suzhou(SYSD2020245, SYS2020177, SKJY2021123); The Fifth Gusu Training Project of Medical Talents in Health System of Suzhou, Jiangsu Province(GSWS2019062, GSWS2020077)

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引用本文：

尹娟, 杨兴, 李平, 徐旻馨, 鲍玉, 张志鹏, 薛慧. 低强度脉冲式超声波在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分化中的抗炎和抗氧化作用[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2023, 17(01): 26-36.

Juan Yin, Xing Yang, Ping Li, Minxin Xu, Yu Bao, Zhipeng Zhang, Hui Xue. The mechanism of anti-inflammatory and antioxidant effects of low-intensity pulsed ultrasound on lipopolysaccharide-induced RAW264.7 macrophage differentiation[J/OL]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2023, 17(01): 26-36.

目的

研究低强度脉冲式超声波（LIPUS）对RAW264.7巨噬细胞极化的影响及相关分子机制。

方法

100 ng/mL脂多糖（LPS）和10 ng/mL白细胞介素（IL）-4诱导巨噬细胞RAW264.7分别向M1和M2型极化，45 mW/cm²强度LIPUS对巨噬细胞处理25 min。采用流式细胞术检测巨噬细胞氧化应激活性氧（ROS）水平、M1分化标志物CD80和CD11b，以及M2分化标志物CD163的表达水平。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测CD80、CD11b、核转录因子κB（NF-κB）p65、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的mRNA水平。采用Western blot技术检测细胞p65、p-p65、TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。采用流式细胞术检测细胞培养上清TNF和IL-6表达水平。

结果

LIPUS可明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞ROS水平。LPS诱导后，RAW264.7细胞M1分化标志物CD80和CD11b表达和转录水平均上调；LIPUS可抑制LPS对RAW264.7细胞向M1的诱导，差异具有统计学意义。并且，LIPUS可促进IL-4诱导的巨噬细胞M2分化标志物CD163表达。LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平上调，LIPUS可下调这些炎症因子的mRNA水平，差异均具有统计学意义。LIPUS抑制了LPS对RAW264.7细胞因子蛋白p65和p-p65、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达上调的作用。胰酶可以通过激活ROS-NF-κB通路，回复LIPUS促进巨噬细胞M1分化的作用。

结论

LIPUS可通过ROS-NF-κB抑制RAW264.7向巨噬细胞M1型分化，促进RAW264.7向巨噬细胞M2型分化。氧化应激和炎症因子表达水平被抑制。LIPUS可能在牙周疾病中起到抑制氧化和炎症的作用，从而发挥对牙周疾病的治疗功能。

关键词: 低强度脉冲式超声波, 氧化应激活性氧, 炎症, 巨噬细胞分化, 牙周疾病

Objective

To study the effects of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) on the polarization of RAW264.7 macrophages and related molecular mechanisms.

Methods

Lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/mL) or IL-4 (10 ng/mL) was used to induce M1 or M2 polarization of macrophages RAW264.7. The macrophages were treated with 45 mW/cm² LIPUS for 25 min. Flow cytometry was used to detect the reactive oxygen species (ROS) level of macrophages and the expression levels of CD80 and CD11b, or CD163, which were markers of M1 or M2. The mRNA levels of CD80, CD11b, NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by RT-PCR. The expression levels of p65, p-p65, TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by Western blot. The expression levels of TNF and IL-6 in the supernatant of cell culture were detected by flow cytometry.

Results

LIPUS could significantly reduce the ROS level of LPS-induced RAW264.7 cells. After LPS induction, the expression and transcription levels of CD80 and CD11b, markers of M1 differentiation, were up-regulated in RAW 264.7 cells. LIPUS inhibited the differentiation induction of LPS on RAW264.7 cells to M1, and the difference was statistically significant. Moreover, LIPUS promoted the expression of CD163, a marker of M2. The mRNA levels of NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells were up-regulated, and LIPUS down-regulated the mRNA levels of these inflammatory factors, with statistically significant differences. LIPUS inhibited the up-regulation of RAW264.7 cytokine proteins p65 and p-p65, IL-1β, TNF-α and IL-6 by LPS. Trypsin restored the role of LIPUS in promoting macrophage M1 differentiation by activating the ROS-NF-κB pathway.

Conclusions

LIPUS inhibited the LPS-induced differentiation of RAW264.7 into macrophages M1 type through ROS-NF-κB, oxidative stress and the expression levels of inflammatory factors of RAW264.7. LIPUS promoted the M2 polarization of RAW264.7. LIPUS may play a therapeutic role in periodontal diseases by inhibiting M1 differentiation of macrophages, which reduced oxidative stress and inflammation.

Key words: Low-intensity pulsed ultrasound, Reactive oxygen species, Inflammation, Macrophage differentiation, Periodontal diseases

表1 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）引物序列

基因	引物序列
β-actin	正向：5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′
	反向：5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′
IL-6	正向：5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3′
	反向：5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′
TNF-α	正向：5′-CCGATGGGTTGTACCTTGTC-3′
	反向：5′-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3′
IL-1β	正向：5′-CAGGCAGGCAGTATCACTCA-3′
	反向：5′-AGGTGCTCATGTCCTCATCC-3′
CD11b	正向：5′-CCAGTACTTCGGGCAGTCTC-3′
	反向：5′-GGCTCTGAGCAGCAGAAGAT-3′
CD80	正向：5′-GGAGATGCTCACGTGTCAGA-3′
	反向：5′-CAACGATGACGACGACTGTT-3′
NF-κB p65	正向：5′-TCAATGGCTACACAGGACCA-3′
	反向：5′-GGCAGAGGTCAGCCTCATAG-3′

表1 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）引物序列

基因	引物序列
β-actin	正向：5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′
	反向：5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′
IL-6	正向：5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3′
	反向：5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′
TNF-α	正向：5′-CCGATGGGTTGTACCTTGTC-3′
	反向：5′-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3′
IL-1β	正向：5′-CAGGCAGGCAGTATCACTCA-3′
	反向：5′-AGGTGCTCATGTCCTCATCC-3′
CD11b	正向：5′-CCAGTACTTCGGGCAGTCTC-3′
	反向：5′-GGCTCTGAGCAGCAGAAGAT-3′
CD80	正向：5′-GGAGATGCTCACGTGTCAGA-3′
	反向：5′-CAACGATGACGACGACTGTT-3′
NF-κB p65	正向：5′-TCAATGGCTACACAGGACCA-3′
	反向：5′-GGCAGAGGTCAGCCTCATAG-3′

图1 低强度脉冲式超声波（LIPUS）抑制100 ng/mL脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞氧化水平　A：LPS诱导RAW264.7分化相差显微镜图；B：LPS诱导RAW264.7分化活性氧（ROS）染色荧光检测；C：LPS诱导RAW264.7分化ROS染色流式检测。

图2 活性氧（ROS）流式检测结果FITC通道平均荧光强度统计图　采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.05，^bP<0.001。

图3 低强度脉冲式超声波（LIPUS）抑制脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞CD80表达　A：流式检测LPS和LIPUS处理后RAW264.7细胞前向散射光和侧向散射光信号变化；B：流式检测RAW264.7细胞巨噬细胞M1分化标志物CD80表达变化；C：流式检测CD80平均荧光强度差异统计；D：RT-PCR检测CD80 mRNA水平差异统计；采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.05，^bP<0.001。

图4 低强度脉冲式超声波（LIPUS）抑制脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞CD11b表达　A：流式检测RAW264.7细胞巨噬细胞M1分化标志物CD11b表达变化。B：流式检测CD11b平均荧光强度差异统计图；C：RT-PCR检测CD11b mRNA水平差异统计图。采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001，^bP<0.05。

图5 低强度脉冲式超声波（LIPUS）促进白细胞介素（IL）-4诱导的RAW264.7向巨噬细胞M2型分化流式细胞图（CD163）

图6 流式检测CD163平均荧光强度差异统计图　采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001。

图7 低强度脉冲式超声波（LIPUS）抑制脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7炎症因子表达　RT-PCR检测p65（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）、IL-6（D）mRNA转录水平；采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001，^bP<0.05；E：Western blot分析p65、p-p65、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平；1：RAW；2：RAW+LPS；3：RAW+LPS+LIPUS；4：RAW+LIPUS。

图8 胰酶（Trypsin）回复低强度脉冲式超声波（LIPUS）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞活性氧（ROS）升高的抑制效应流式细胞图

图9 各组活性氧（ROS）平均荧光强度差异统计图　采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001。

图10 胰酶（Trypsin）回复低强度脉冲式超声波（LIPUS）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞CD80上调的抑制效应流式细胞图

图11 各组CD80荧光强度统计图　采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001，^bP<0.05。

图12 Western blot检测胰酶（Trypsin）回复低强度脉冲式超声波（LIPUS）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞p65、p-p65、IL-6和TNF-α表达上调的抑制效应　1：RAW；2：RAW+LPS；3：RAW+LPS+LIPUS；4：RAW+LIPUS；5：RAW+LPS+LIPUS+Trypsin。

图13 流式细胞检测各组上清液中白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）蛋白表达水平差异　采用One-Way ANOVA分析统计组间差异，^aP<0.001，^bP<0.05。

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