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中华口腔医学研究杂志(电子版)

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2015, Vol. 09 ›› Issue (06) : 461 -469. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2015.06.005

所属专题： 文献；

基础研究

纯钛微纳米复合形貌对成骨细胞生物学行为的影响
许嘉允1, 邓飞龙1,†(), 庄秀妹2, 欧阳江林3, 刘芸1, 王婧1, 李夏晨1   
  1. 1. 510055　广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室
    2. 510120　广州，中山大学附属孙逸仙纪念医院口腔科
    3. 511458　广州中国科学院先进技术研究所
  • 收稿日期:2015-08-30 出版日期:2015-12-01
  • 通信作者: 邓飞龙
  • 基金资助:
    广东省自然科学基金(S2013010015805)

The influence of different hybrid micro/nano hierarchical titanium topographies on osteoblast biological functions

Jiayun Xu1, Feilong Deng1,†(), Xiumei Zhuang2, Jianglin Ou-Yang3, Yun Liu1, Jing Wang1, Xiachen Li1   

  1. 1. Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, China
    2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510235, China
    3. Guangzhou Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Science, Guangzhou 511458, China
  • Received:2015-08-30 Published:2015-12-01
  • Corresponding author: Feilong Deng
  • About author:
    Corresponding author: Deng Feilong, Email: , Tel: 020-83862537
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引用本文：

许嘉允, 邓飞龙, 庄秀妹, 欧阳江林, 刘芸, 王婧, 李夏晨. 纯钛微纳米复合形貌对成骨细胞生物学行为的影响[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2015, 09(06): 461-469.

Jiayun Xu, Feilong Deng, Xiumei Zhuang, Jianglin Ou-Yang, Yun Liu, Jing Wang, Xiachen Li. The influence of different hybrid micro/nano hierarchical titanium topographies on osteoblast biological functions[J/OL]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2015, 09(06): 461-469.

目的

对比研究纯钛表面不同微纳米图案对成骨细胞生物学活性的影响，探讨微米与纳米结构在影响细胞行为当中的不同作用。

方法

制备4组纯钛微纳米复合表面形貌：喷砂（S）、喷砂-酸蚀（SLA）、喷砂-碱热（SAH）及喷砂-阳极氧化（SAN）。检测各组材料表面理化性能，扫描电镜观察各组材料表面形貌及细胞黏附形态，CCK-8法测定细胞在材料表面增殖能力，碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞在材料表面分化能力。利用单因素方差分析进行统计分析，最小有意义差异（LSD）t检验对同时间点不同组的CCK-8及ALP结果进行比较。

结果

（1）粗糙度结果示：SLA组粗糙度大于其余3组，差异有统计学意义（FRa = 38.449，PRa<0.001；FRq = 29.564，PRq<0.001）。（2）扫描电镜示：S组仅形成弹坑状一级微米结构，黏附细胞伪足短小，SLA、SAH及SAN组分别修饰沟壑状、网状及管状二级纳米多孔图案，细胞于SAH、SAN组表面伪足更为伸展，其中SAH组表面细胞伪足生长进入孔隙形成机械锁结。（3）CCK-8结果示：第5天，SAH和SAN组细胞增殖A值（1.546和1.528）显著高于S组（1.31），差异有统计学意义（F = 3.229，P = 0.042）；第7天时，SAH和SAN组细胞增殖A值（2.646和2.57）显著高于S组（2.24），差异有统计学意义（F = 3.51，P = 0.035）。（4）细胞分化检测示：接种7 d后，SAH组ALP活性（77.656）显著高于S、SLA及SAN组（53.132、51.052和62.207），差异有统计学意义（F = 29.734，P<0.001）；接种14 d后，SAH与SAN组ALP活性（104.107和109.963）显著高于S与SLA两组（82.885和73.303），差异有统计学意义（F = 46.052，P<0.001）。

结论

钛片表面微纳米图案影响细胞伪足形态，促进细胞增殖及ALP活性，其中多孔形貌显著增加细胞活性，碱热处理表面早期ALP活性显著增加，且形成纳米网比纳米管更有利于形成机械锁结。

关键词: 表面改性, 微纳米结构, 纯钛, 纳米网, 纳米管
Objective

To compare different effects of cells on titanium surfaces with different micro/nano structures, and to evaluate different functions of micro- and nano-features, respectively.

Methods

All the titanium disc samples were divided into four groups and accepted the following treatments: (1) sandblasted only (S) ; (2) sandblasted followed by acid-etching (SLA) ; (3) sandblasted followed by alkali-heat (SAH) ; (4) sandblasted followed by anodizing (SAN) . The surface topography, elemental component and roughness of samples were examined. Surface biocompatibility and osteogenic capability were evaluated by cell counting kit (CCK-8) and alkaline phosphate activity (ALP) in vitro. The level of significance was determined by a one-way ANOVA followed by a least significant difference (LSD) t-test for a multiple comparison procedure.

Results

Surface of group S were showed only microtopography of pits, while the other three groups exhibited primary micro-structure modified by secondary nano-features of ditches (SLA) , nano-porous network layers (SAH) and nanotubes (SAN) , respectively. There was no significant difference of cell adhesion and proliferation in the 1st and 3rd day. Group SAH and SAN (1.546 and 1.528) enhanced cell proliferation significantly than Group S (1.31) in the 5th day (F = 3.229, P = 0.042) , in the 7th day, Group SAH and SAN (2.646 and 2.57) also significantly enhanced cell proliferation than Group S (2.24) (F = 3.51, P = 0.035) and induced affluent and stretched cell pseudopods. Moreover, pseudopods on the surface of group SAH grow into the network and wrap around the net to link to each other. In comparison, group SAH (77.656) significantly enhanced ALP activity in the 7th day than Group S, SLA and SAN (53.132, 51.052 and 62.207, respectively) (F = 29.734, P<0.001) , though the ALP activity of group SAN depressed in the early stage but enhanced significantly than Group S and SLA (82.885 and 73.303) in the 14th day (F = 46.052, P<0.001) .

Conclusions

Microstructures decided the roughness while nanostructures, especially nano-porous functioned in enhancing cell proliferation and differentiation. The forms of nano-porous induced cell pseudopods stretch, for which nano-porous network allowed cells to grow into and form extensive interlocking.

Key words: Surface modification, Micro/Nano structure, Titanium, Nano networks, Nanotubes
图1 4组钛片表面处理后的样品图
表1 EDS检测4组钛片表面元素的组成情况（%）
组别 钛 氧 碳 镁 钙
S组 99.86 0.14 - - -
SLA组 75.16 17.34 7.50 - -
SAH组 35.13 49.66 13.89 0.36 0.28
SAN组 52.73 36.65 5.59 - -
图2 4组钛片经不同表面处理后在低倍扫描电镜下的表面形态
图3 4组钛片经不同表面处理后在高倍扫描电镜下的微观表面形态
表2 4组钛片表面粗糙度的比较（μm， ± s）
组别 样品数 Ra Rq
S组 6 1.55 ± 0.08 1.87 ± 0.10
SLA组 6 1.90 ± 0.07 2.33 ± 0.10
SAH组 6 1.46 ± 0.04 1.87 ± 0.09
SAN组 6 1.55 ± 0.06 1.91 ± 0.06
图4 低倍扫描电镜下4组钛片表面接种MC3T3-E1细胞后在各时间点的细胞黏附形态
图5 高倍扫描电镜下4组钛片表面接种MC3T3-E1细胞后4 h的细胞伪足形态
图6 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点细胞增殖的比较
表3 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点细胞增殖的比较（A值， ± s）
组别 样品数 A值
1d 3d 5d 7d
S组 3 0.467 ± 0.015 1.210 ± 0.098 1.308 ± 0.072 2.246 ± 0.146
SLA组 3 0.491 ± 0.031 1.343 ± 0.174 1.385 ± 0.135 2.364 ± 0.100
SAH组 3 0.495 ± 0.041 1.399 ± 0.029 1.546 ± 0.107 2.646 ± 0.258
SAN组 3 0.514 ± 0.038 1.356 ± 0.094 1.528 ± 0.142 2.565 ± 0.087
F值 ? 2.498 1.263 3.229 3.512
P值 ? 0.092 0.318 0.042 0.035
图7 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点细胞总蛋白浓度的比较
图8 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点细胞碱性磷酸酶活性的比较
表4 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点细胞总蛋白浓度的比较（μg/ml， ± s）
组别 样品数 总蛋白质量浓度
7 d 14 d
S组 3 153.277 ± 17.149 287.080 ± 4.379
SLA组 3 164.066 ± 24.785 271.138 ± 16.531
SAH组 3 193.203 ± 18.822 331.664 ± 13.467
SAN组 3 174.092 ± 28.045 338.398 ± 22.023
F值 ? 2.594 17.238
P值 ? 0.048 <0.001
表5 MC3T3-E1细胞在4组钛片表面各时间点碱性磷酸酶活性的比较（U/gprot， ± s）
组别 样品数 ALP活性
7 d 14 d
S组 3 53.132 ± 3.687 82.885 ± 6.168
SLA组 3 51.052 ± 2.122 73.303 ± 4.716
SAH组 3 77.656 ± 5.384 104.107 ± 3.076
SAN组 3 62.207 ± 2.254 109.963 ± 2.912
F值 ? 29.734 46.052
P值 ? <0.001 <0.001
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