碱性成纤维细胞因子在人牙髓损伤修复过程中的表达

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2014.06.001

目的

研究不同状态人牙髓组织中碱性成纤维细胞因子（bFGF）的表达特点，以及大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激后人牙髓细胞（hDPC）中bFGF 的表达水平，探讨bFGF 在牙髓损伤修复过程中的可能作用。

方法

采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和免疫蛋白印迹方法（Western blot）分别检测正常、深龋及牙髓炎牙髓组织中bFGF mRNA 和蛋白表达情况。实时荧光定量PCR 测定1 mg/L LPS 刺激hDPC 6、12、24、48 h 后bFGF 和热休克蛋白70（HSP70）表达水平的变化；Western blot 和细胞免疫荧光染色检测LPS 刺激hDPC 后bFGF 蛋白表达变化。

结果

实时荧光定量PCR 和Western blot 结果表明，深龋牙髓组织中bFGF 水平显著上调，而正常和牙髓炎牙髓组织中bFGF 表达无差异。实时荧光定量PCR 检测到LPS 刺激hDPC 后，bFGF 和HSP70 mRNA 水平同步上调，在12 h 达峰值；Western blot 显示，LPS 刺激hDPCs 12、24、48 h 后bFGF 蛋白表达水平均高于正常hDPC；细胞免疫荧光染色证实，LPS 刺激12 h 后hDPC 中bFGF 呈强阳性表达，而正常hDPC中bFGF呈弱阳性表达。

结论

bFGF 在深龋牙髓组织中高表达，且LPS 刺激早期可上调hDPC 内bFGF 表达，推测bFGF 可能参与牙髓组织防御修复反应，可能是细胞抗损伤的重要调节机制之一。

关键词: 碱性成纤维细胞因子, 脂多糖, 牙髓细胞, 损伤修复

Objective

To investigate the expression of basic fibroblast growth factor （bFGF） in human dental pulp tissues of different state and the bFGF level in human dental pulp cells （hDPCs）stimulated by lipopolysaccharide （LPS）， and explore the potential role of bFGF in the progress of repairing pulp injury.

Methods

The messenger RNA and protein level of bFGF in normal and inflammatory pulp were detected by fluorescence quantitative-polymerase chain reaction （qPCR） and western blot. HDPCs were collected after stimulated by 1 mg/L LPS for 6， 12， 24 and 48 h. The expression of bFGF and HSP70 in hDPCs was evaluated by qPCR. In addition， the protein level of bFGF in in normal and LPS treated hDPCs were detected by western blot and immunofluorescence staining.

Results

The mRNA and protein level of bFGF was significantly up-regulated in the pulp with deep caries compared with healthy pulps， while inflamed dental pulp did not show significant difference.QPCR showed that bFGF and HSP70 mRNA were concomitantly increased from 0 h to 12 h after stimulated by LPS. Similarly， it was shown that bFGF was increased in LPS treated hDPCs compared with normal hDPCs by western blot. Moreover， immunofluorescence staining results demonstrated that bFGF was strongly positive stained in LPS treated hDPCs， while it was weakly expressed in normal hDPCs.

Conclusion

BFGF is up-regulated in pulp with deep caries and hDPCs induced by LPS，indicating that bFGF may participates in the progress of repairing pulp injury.

Key words: Basic fibroblast growth factor, Lipopolysaccharide, Dental pulp cells, Repair of pulp injury

表1 RT-PCR 引物序列

基因	引物序列
bFGF	F：5'-CCCGACGGCCGAGTTGAC-3'
	R：5'-TTCATAGCCAGGTAACGGTTAGC-3'
HSP70	F：5'-AGTTTGCAACCCCATCATCAC-3'
	R：5'-AAATCCCCCAGGCATTCCT-3'
GADAH	F：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'
	R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'

表1 RT-PCR 引物序列

基因	引物序列
bFGF	F：5'-CCCGACGGCCGAGTTGAC-3'
	R：5'-TTCATAGCCAGGTAACGGTTAGC-3'
HSP70	F：5'-AGTTTGCAACCCCATCATCAC-3'
	R：5'-AAATCCCCCAGGCATTCCT-3'
GADAH	F：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'
	R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'

图1 不同牙髓组织bFGF mRNA 的表达差异注：与正常牙髓组织比较，^aP ＜0.05

图2 不同牙髓组织bFGF 蛋白的表达差异注：与正常牙髓组织比较，^aP ＜0.05

图3 1 mg/L LPS 刺激hDPC 后bFGF 表达变化注：与0 h 对照组比较，^aP ＜0.05

图4 1 mg/L LPS 刺激hDPC 后HSP70 表达变化注：与0 h 对照组比较，^aP ＜0.05

图5 1 mg/L LPS 刺激hDPC 后bFGF 蛋白的表达变化注：与0 h 对照组比较，^aP ＜0.05

图6 正常及LPS 刺激hDPC 中bFGF 免疫荧光表达（× 400）注：细胞免疫荧光染色示正常hDPC 中bFGF 在胞浆呈弱阳性表达（图6A 为DAPI 染核；图6C 为免疫荧光染色；图6E 为图6A和图6C 融合的图片）；而经1 mg/L LPS 刺激12 h 后hDPC 中bFGF 呈强阳性表达（图6B 为DAPI 染核；图6D 为免疫荧光染色；图6F 为图6B 和图6D 融合的图片）

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