Oct4 基因转染对人牙髓细胞增殖和多向分化能力的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2013.03.002

目的

研究腺病毒介导的转录因子Oct4 转染人牙髓细胞（DPCs）对其增殖和多向分化能力的影响。

方法

以Admax 包装系统构建携带目的基因Oct4 和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒载体Ad5-Oct4-EGFP，筛选最佳感染复数（MOI）转染DPCs，检测其增殖及成牙本质、成脂分化能力的改变。

结果

采用Admax 包装系统成功构建并获得高滴度的腺病毒载体，筛选最适MOI=200，CCK-8 检测结果显示，Ad5-Oct4-EGFP 组2 d 起吸光度（A）值高于对照组，7、14 d 与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），矿化诱导21 d 后，茜素红染色显示Ad5-Oct4-EGFP 组与对照组相比，矿化结节数量多且体积最大，实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）结果显示，DSPP、BSP 和CollagenⅠmRNA 的表达量高于对照组（P＜0.05）；成脂诱导后细胞胞体呈立方状，油红O 染色显示Ad5-Oct4-EGFP 组细胞浆内出现较多脂滴，脂肪特异性标志LPL 和PPARγ2 mRNA 水平较对照组显著上调（P＜0.05），Ad5-EGFP 和空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

结论

转录因子Oct4 可促进DPCs 增殖和多向分化能力，改善DPCs 的干性。

关键词: 牙髓细胞, 转录因子Oct4, 增殖, 多向分化

Objective

To investigate the effect of Ad5-Oct4-EGFP transfection on the proliferation and multilineage differentiation capabilities of human dental pulp cells（DPCs）.

Methods

The recombinant adenovirus was constructed by Admax system which carried transcription factor and enhanced green fluorescence protein enhanced green fluorescent protein （EGFP）， and the optimal multiplicity of infection（MOI） was selected. After transfection， CCK-8 was used to examine the proliferation of transfected cells at days 1， 2， 3， 5， 7 and 14. Transfected DPCs were cultured in the odontogenic and adipogenic induction media for 21 days respectively. Odontogenic and adipogenic differentiation was investigated by Alizarin Red staining and Oil Red O staining， and the odontogenic and adipogenic differentiation markers were evaluated by RT-PCR.

Results

The recombinant adenoviral vector of Oct4 gene was successfully constructed and the MOI value of 200 was selected as the optimal MOI for the further study. The CCK-8 test revealed that the OD value in Ad5-Oct4-EGFP transfected cells was higher than that in the control groups at day 2， with significant increase at day 7 and day 14 （P＜0.05）. The results of Alizarin Red staining indicated that Oct4 gene transfection promoted more calcified nodules formation in Ad5-Oct4-EGFP group. DSPP， BSP and collagen I mRNA expression levels were significantly greater in Ad5-Oct4-EGFP transinfected cells than those of the control groups at days 21 （P＜0.05）. Adipogenic differentiation was demonstrated by the large accumulation of neutral lipid vacuoles indicated by the Oil Red O stain in Ad5-Oct4-EGFP group， and further confirmed by the significant up-regulation of LPL and PPARγ2 mRNAs compared with the control groups （P＜0.05）.

Conclusion

Our study has demonstrated Oct4 can improve the proliferation and multilineage differentiation capablity of cultured DPCs.

Key words: Dental pulp cells, Transcription factor Oct4, Proliferation, Multilineage differentiation

表1 矿化诱导分化基因的实时荧光定量RT-PCR 引物序列

基因	引物序列	大小（bp）
DSPP	正向：5'-GGGATGTTGGCGATGCA-3'	174
	反向：5'-CCAGCTACTTGAGGTCCATCTTC-3'
BSP	正向：5'-CAGAGGCAGAAAACGGCAAC-3'	105
	反向：5'-TTCCGGTCTCTGTGGTGTCTT-3'
CollagenⅠ	正向：5'-CCTGCGTGTACCCCACTCA-3'	105
	反向：5'-ACCAGACATGCCTCTTGTCCTT-3'
β-actin	正向：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'	106
	反向：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'

表1 矿化诱导分化基因的实时荧光定量RT-PCR 引物序列

基因	引物序列	大小（bp）
DSPP	正向：5'-GGGATGTTGGCGATGCA-3'	174
	反向：5'-CCAGCTACTTGAGGTCCATCTTC-3'
BSP	正向：5'-CAGAGGCAGAAAACGGCAAC-3'	105
	反向：5'-TTCCGGTCTCTGTGGTGTCTT-3'
CollagenⅠ	正向：5'-CCTGCGTGTACCCCACTCA-3'	105
	反向：5'-ACCAGACATGCCTCTTGTCCTT-3'
β-actin	正向：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'	106
	反向：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'

表2 成脂诱导分化基因的实时荧光定量RT-PCR 引物序列

基因	引物序列	大小（bp）
LPL	正向：5'-TGTGGTGGACTGGCTGTCA-3'	73
	反向：5'-CTGTCCCACCAGTTTGGTGTAG-3'
PPARγ2	正向：5'-GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC-3'	74
	反向：5'-AACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG-3'
β-actin	正向：5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'	106
	反向：5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'

表2 成脂诱导分化基因的实时荧光定量RT-PCR 引物序列

基因	引物序列	大小（bp）
LPL	正向：5'-TGTGGTGGACTGGCTGTCA-3'	73
	反向：5'-CTGTCCCACCAGTTTGGTGTAG-3'
PPARγ2	正向：5'-GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC-3'	74
	反向：5'-AACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG-3'
β-actin	正向：5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'	106
	反向：5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'

图1 转染后不同时间点DPCs 增殖能力的变化与同一时间点的Ad5-EGFP 和空白对照组相比^aP＜0.05

图2 不同组DPCs 矿化诱导21 d 后茜素红染色（A、C、E ×100；B、D、E ×200） A ～B：Ad5-Oct4-EGFP 组；C ～D：Ad5-EGFP 组；E ～F：空白对照组

图3 不同组DPCs 矿化诱导21 d，DSPP、BSP 和CollagenⅠmRNA 的表达情况与Ad5-EGFP 和空白对照组相比^aP＜0.05

图4 不同组DPCs 成脂诱导后油红O 染色（A、C、E ×100；B、D、E ×200）红色为细胞内的脂滴。 A～B：Ad5-Oct4-EGFP 组；C～D：Ad5-EGFP组；E ～F：空白对照组

图5 不同组DPCs 成脂诱导后LPL 和PPARγ2 mRNA 的表达情况与Ad5-EGFP 和空白对照组相比^aP＜0.05

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