口腔变形链球菌感受态刺激因子的蛋白合成及活性检测

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.06.002

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2012, Vol. 06 ›› Issue (06) : 484 -489. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.06.002

基础研究

口腔变形链球菌感受态刺激因子的蛋白合成及活性检测

张恺¹, 霍丽珺¹, 凌均棨¹^,^†(

), 刘佳¹, 麦俊妮¹

1.510055 广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室

收稿日期:2012-02-08 出版日期:2012-12-01
通信作者: 凌均棨
基金资助:
国家自然科学基金(30973320、81000432)教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20100171120102)广东省高校优秀青年创新人才培育项目(育苗工程,LYM10002)中央高校基本科研业务费专项资金(09ykpy65)广东省医学科学技术基金(A2010197)中大重大项目培育和新兴、交叉学科资助计划(10ykjc16)

Chemical synthesis and biological activities of competence stimulated peptide of quorum sensing system in Streptococcus mutans UA159

Kai ZHANG¹, Li-jun HUO¹, Jun-qi LING¹^,^†(), Jia LIU¹, Jun-ni MAI¹

1.Guanghua School of Stomatology， Hospital of Stomatology， Sun Yat-sen University， Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology， Guangzhou 510055， China

Received:2012-02-08 Published:2012-12-01
Corresponding author: Jun-qi LING

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目的

探讨口腔变形链球菌（S.mutans）密度感应系统信号蛋白的体外合成及其生物活性。

方法

采用化学合成法口腔S.mutans 密度感应感受态刺激因子（CSP）信号蛋白，通过高效液相色谱仪纯化合成蛋白，质谱分析结构，通过扫描电镜对比观察CSP 信号蛋白对S.mutans 生物膜形成的影响，分析CSP 信号蛋白的生物活性。

结果

化学合成纯化S.mutans CSP 蛋白分子，加入CSP 信号肽后，S.mutans 生物膜呈团状密集分布，细菌之间存在厚实的黏性胞外分泌物，细菌黏连呈链团状。

结论

成功合成口腔S.mutans CSP 信号蛋白，该蛋白肽具备促进S.mutans 生物膜形成的生物活性。

关键词: 变形链球菌, 密度感应, 信号肽, 化学合成

Objective

To synthesize and analyze the biological activities of the competence stimulated peptide （CSP） in Streptococcus mutans （S.mutans） quorum sensing system.

Methods

The CSP peptide derived from S.mutans UA159 comC gene N-terminal 26-46 was chemically synthesized and purified. The biological activity of CSP， which was used as a quorum-sensing signal in S.mutans biofilm formation CSP， was analyzed by scanning electron microscope （SEM）.

Results

The CSP was accurately synthesized， and SEM confirmed the addition of chemically synthetic CSP induced the adhesion of S.mutans cells and significantly increased the biofilm formation of S.mutans.

Conclusion

The CSP was chemically synthesized with biological activities， which made it possible to study the mechanism of quorum sensing system in S.mutans.

Key words: Streptococcus mutans, ComCDE system, Signaling peptide, Quorum sensing

表1 肽链合成氨基酸用量

氨基酸	重量（mg）
甘氨酸Fmoc-Gly-OH	64.22
亮氨酸Fmoc-Leu-OH	76.34
丙氨酸Fmoc-Ala-OH	67.25
谷氨酰胺Fmoc-Gln（Trt）-OH	131.92
苏氨酸Fmoc-Thr（tBu）-OH	85.86
苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH	83.69
丝氨酸Fmoc-Ser（tBu）-OH	82.83
精氨酸Fmoc-Arg（Pmc）-OH.IPE	165.24
天冬氨酸Fmoc-Asn（Trt）-OH	128.89

表1 肽链合成氨基酸用量

氨基酸	重量（mg）
甘氨酸Fmoc-Gly-OH	64.22
亮氨酸Fmoc-Leu-OH	76.34
丙氨酸Fmoc-Ala-OH	67.25
谷氨酰胺Fmoc-Gln（Trt）-OH	131.92
苏氨酸Fmoc-Thr（tBu）-OH	85.86
苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH	83.69
丝氨酸Fmoc-Ser（tBu）-OH	82.83
精氨酸Fmoc-Arg（Pmc）-OH.IPE	165.24
天冬氨酸Fmoc-Asn（Trt）-OH	128.89

图1 CSP 多肽的高效液相色谱分析图谱

图2 CSP 合成多肽的质谱图

图3 SignalP 3.0 Server 预测分析显示该多肽为信号肽

表2 CSP 信号肽氨基酸序列

菌种	CSP 前体氨基酸序列	CSP 信号肽序列
S.mutans UA159	MKKTLSLKNDFKEIKTDELEIIIGG^SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK	SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK

表2 CSP 信号肽氨基酸序列

菌种	CSP 前体氨基酸序列	CSP 信号肽序列
S.mutans UA159	MKKTLSLKNDFKEIKTDELEIIIGG^SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK	SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK

表3 ExPASy 序列分析结果

氨基酸数	分子量	分子式	PI	稳定指数	稳定分类	GRAVY	脂肪指数
21	2364.6	C₁₀₈H₁₆₆N₃₀O₃₀	12.01	28.69	stable	-0.043	60.48

表3 ExPASy 序列分析结果

氨基酸数	分子量	分子式	PI	稳定指数	稳定分类	GRAVY	脂肪指数
21	2364.6	C₁₀₈H₁₆₆N₃₀O₃₀	12.01	28.69	stable	-0.043	60.48

图4 口腔变形链球菌24 h 生物膜扫描电镜图（ × 3000） A：对照组（未加入CSP 蛋白肽）； B：实验组（加入CSP 蛋白肽）

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