变形链球菌荧光报告株的构建和鉴定

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.06.001

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2012, Vol. 06 ›› Issue (06) : 479 -483. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.06.001

基础研究

变形链球菌荧光报告株的构建和鉴定

霍丽珺¹, 刘红艳¹, 凌均棨¹^,^†(

), 黄湘雅¹

1.510055 广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室

收稿日期:2012-05-27 出版日期:2012-12-01
通信作者: 凌均棨
基金资助:
国家自然科学基金（30973320）中山大学重大项目培育和新兴、交叉学科资助计划（10ykjc16）

The construction and identification of the ldh-luc reporter strain of Streptococcus mutans and the reporter strain

Li-jun HUO¹, Hong-yan LIU¹, Jun-qi LING¹^,^†(), Xiang-ya Huang¹

1.Guanghua School of Stomatology， Hospital of Stomatology， Sun Yat-sen University， Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology， Guangzhou 510055， China

Received:2012-05-27 Published:2012-12-01
Corresponding author: Jun-qi LING

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目的

探讨变形链球菌（S.mutans）荧光素酶（luc）基因报告株构建方法，拟为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans 的作用提供研究基础。

方法

将S.mutans UA159 乳酸脱氢酶（ldh）基因及其上游部分约1 100 000 片段克隆至自杀质粒pFW5-luc 的多克隆位点，构建重组质粒，并经酶切和测序证实。采用自然转化的方法，实现重组自杀质粒和S.mutans UA159 同源序列的单次交换。

结果

经过聚合酶链反应（PCR）和测序分析，筛选出具有报告活性的S.mutans ldh-luc基因荧光报告株。

结论

成功构建了S.mutans ldh-luc 基因荧光报告株。

关键词: 变形链球菌, 荧光素酶, 同源重组, ldh-luc 荧光报告株

Objective

To construct the ldh-luc reporter strain of Streptococcus mutans （S.mutans） and identity the reporter strain.

Methods

Approximately 1 100 000 of sequence upstream of the ldh start codon from S.mutans genome were amplified and cloned to the suicide vector pFW5-luc.Confirmed constructs were transformed into S.mutans and integrated via single crossover homologous recombination. The expected integration was confirmed in antibiotic-resistant clones by PCR and sequencing.

Results

The ldh-luc reporter strain of S.mutans was selected and confirmed by PCR and sequencing analysis of multiple clones for similar reporter activity.

Conclusion

An ldh-luc reporter strain of S.mutans was constructed successfully.

Key words: Streptococcus mutans, Luciferase, Homologous recombination, Ldh-luc reporter strain

表1 实验用菌株和质粒

名称	来源	相关特性
S.mutans UA159	广东省口腔医学重点实验室	Wild type，Erm^s，Spec^s，Kan^s，野生株，对红霉素、壮观霉素及卡那霉素敏感
E.coli JM109	日本TaKaRa 公司	recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，e14-（mcrA-），supE44，relA1，（lac-proAB）/F，c LacZ；Ampr
pMD19-T	日本TaKaRa 公司	含有beta 一半乳糖苷酶编码基因LacZ，对氨苄青霉素敏感 Spec^s，luc
pFW5-luc	美国加州大学洛杉矶分校施文元教授惠赠	含有荧光素酶luc 基因，对壮观霉素敏感 LacZ；Amp^rldh-Insert
pMD19-ldh	本实验构建	含有beta 一半乳糖苷酶编码基因LacZ，对氨苄青霉素敏感，插入了ldh 基因及其上游部分片段
pJM1-ldh	本实验构建	Spec^rluc；luc under S.mutans ldh promoter luc 基因插入到S.mutans ldh 启动子下游；对壮观霉素敏感

表1 实验用菌株和质粒

名称	来源	相关特性
S.mutans UA159	广东省口腔医学重点实验室	Wild type，Erm^s，Spec^s，Kan^s，野生株，对红霉素、壮观霉素及卡那霉素敏感
E.coli JM109	日本TaKaRa 公司	recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，e14-（mcrA-），supE44，relA1，（lac-proAB）/F，c LacZ；Ampr
pMD19-T	日本TaKaRa 公司	含有beta 一半乳糖苷酶编码基因LacZ，对氨苄青霉素敏感 Spec^s，luc
pFW5-luc	美国加州大学洛杉矶分校施文元教授惠赠	含有荧光素酶luc 基因，对壮观霉素敏感 LacZ；Amp^rldh-Insert
pMD19-ldh	本实验构建	含有beta 一半乳糖苷酶编码基因LacZ，对氨苄青霉素敏感，插入了ldh 基因及其上游部分片段
pJM1-ldh	本实验构建	Spec^rluc；luc under S.mutans ldh promoter luc 基因插入到S.mutans ldh 启动子下游；对壮观霉素敏感

图1 pJM1-ldh 质粒及pFW5-luc 质粒双酶切产物电泳 M1：λ-Hind ⅢDNA Marker；M2：DL2000 DNA Marker；1：pFW5-luc质粒酶切产物；2：pJM1-ldh 质粒酶切产物

图2 pJM1-ldh 质粒双酶切后电泳结果 M1：λ-HindⅢDNA Marker； M2：DL2000 DNA Marker； 1：pFW5-luc Vector； 2：pJM1-ldh-1 酶切产物； 3：pJM1-ldh-2 酶切产物； 4：pJM1-ldh Insert

图3 S.mutans 转化株PCR 产物电泳 M：1 000 000 DNA Ladder Marker； 1 ～6：S.mutans 转化株PCR 产物；7 ～8：S.mutans UA159 野生株PCR 产物； 9 ～10：pJM1-ldh PCR 产物

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