涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA 的筛选

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2010.06.005

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2010, Vol. 4 ›› Issue (06) : 563 -569. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2010.06.005

基础研究

涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA 的筛选

林钊宇¹, 李劲松¹^,^†(

), 武东辉², 张伟¹, 黄洪章³, 潘朝斌¹, 陈伟良¹, 黄志权¹, 王友元¹

1.510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科
2.广州市海珠区口腔医院
3.中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所

收稿日期:2010-06-23 出版日期:2010-12-01
通信作者: 李劲松
基金资助:
国家自然科学基金(81072225)广东省自然科学基金重点项目(10251008901000022)广东省自然科学基金(915100890100 0201)广州市科技计划项目(2008Z1-E201)

Screening of differentially expressed microRNA related with invasion and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma

Zhao-yu LIN¹, Jin-song LI¹^,^†(), Dong-hui WU¹, Wei ZHANG¹, Hong-zhang HUANG¹, Chao-bin PAN¹, Wei-liang CHEN¹, Zhi-quan HUANG¹, Youyuan WANG¹

1.Department of Oral & Maxillofacial Surgery， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Received:2010-06-23 Published:2010-12-01
Corresponding author: Jin-song LI

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引用本文：

林钊宇, 李劲松, 武东辉, 张伟, 黄洪章, 潘朝斌, 陈伟良, 黄志权, 王友元. 涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA 的筛选[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2010, 4(06): 563-569.

Zhao-yu LIN, Jin-song LI, Dong-hui WU, Wei ZHANG, Hong-zhang HUANG, Chao-bin PAN, Wei-liang CHEN, Zhi-quan HUANG, Youyuan WANG. Screening of differentially expressed microRNA related with invasion and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma[J/OL]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2010, 4(06): 563-569.

目的

探讨不同转移能力涎腺腺样囊性癌（ACC）表达微小RNA（miRNA）的差异，以期筛选与ACC 侵袭转移相关的miRNA 及其所调控的靶基因。

方法

以ACC 高转移细胞株（ACC-M）为实验组，低转移细胞株（ACC-2）为对照组，采用高通量miRNA 微阵列初步筛选两株细胞中差异表达的内源性miRNA，然后挑选几个显著差异表达的miRNA，采用实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）进一步加以验证，同时运用miRNA 靶基因预测软件预测其可能调控的靶基因。

结果

芯片初筛显示，与ACC-2 相比，ACC-M 中表达差异具有统计学意义的miRNA分子有23 个，其中上调表达的有14 个（miR-15a、miR-16、miR-509-3p 等），下调表达的有9 个（miR-24、miR-98、miR-320 等）。qRT-PCR 验证与miRNAs 芯片结果相符合。靶基因软件预测显示，miR-98 的靶基因为Ras 和高迁移率蛋白A2，miR-320 的靶基因为整合素β3，miR-509-3p的靶基因为CD164，它们均与恶性肿瘤侵袭转移有关。

结论

不同转移能力的ACC 存在差异表达的miRNA、miR-98、miR-320 和miR-509-3p 可能与ACC 侵袭转移相关，可能通过调控相关靶基因参与ACC 的侵袭转移进程。

关键词: 微小RNA, 涎腺腺样囊性癌, 侵袭, 转移, 靶基因

Objective

To investigate the differentially expressed microRNAs and their target genes related with invasion and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma（ACC）.

Methods

ACC-M（experimental group） and ACC-2（control group） cells were cultivated，and their endogenous different microRNAs were screened by high-throughput microRNA microarray， and then several significant different microRNAs were selected to be verified by qRTPCR assay.Meanwhile， their target genes were predicted by miRNA target gene prediction programs.

Results

MicroRNA microassay showed that 23 microRNAs were changed in ACC-M compared with that in ACC-2， including a set of 14 overexpressed microRNAs （miR-15a， miR-16， miR-509-3p， et al.） and 9 downexpressed miRNAs （miR-24， miR-98， miR-320， et al.），which was accordant with the results of qRT-PCR assay.Ras and HMGA2 were the predicted target genes of miR-98，and ITGβ3 and CD164 were the target gene of miR-320 and miR-509-3p respectively， which were all related with invasion and migration.

Conclusions

There are differentially expressed microRNAs between ACC-M and ACC-2.MiR-98，miR-320 and miR-509-3p might involve in the process of invasion and migration of ACC by regulating the expression of its target genes.

Key words: MicroRNA, Adenoid cystic carcinoma, Invasion, Migration, Target gene

表1 miRNA 实时定量RT-PCR 的引物

名称	引物		序列（5'→3'）
miR-98	RT引物		GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACAACAAT
	PCR引物	正向	CTGAGCGGTGAGGTAGTAAGTTGTA
		反向	ATTCCATGAGAGATCCCTAGCGT
miR-24	RT引物		GTCGCATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTCAACGAATGCGACCTGTTC
	PCR引物	正向	ACTAAGCTGGCTCAGTTCAGCAGG
		反向	ATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGT
miR-320a	RT引物		GTCGCATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTCAACGAATGCGACTCGCCC
	PCR引物	正向	ACTATGGAAAAGCTGGGTTGAGAG
		反向	ATTCGTTGAGAGATCACAAGCGT
miR-320c	RT引物		GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACACCCTC
	PCR引物	正向	ACTAAGCGAAAAGCTGGGTTGAG
		反向	ATTCCATGAGAGATCCCTAGCGT
miR-23b	RT引物		GTCGCATTGCATGAGAGATCACTAGCGTCATGCAATGCGACGGTAAT
	PCR引物	正向	ACTAAGATCACATTGCCAGGGA
		反向	ATTGCATGAGAGATCACTAGCGT
miR-509-3p	RT引物		GTCGCATTCCTTGAGAGATGACTACCGACAAGGAATGCGACCTACCC
	PCR引物	正向	ACTTAGGTGATTGGTACGTCTGTG
		反向	ATTCCTTGAGAGATGACTACCGA

表1 miRNA 实时定量RT-PCR 的引物

名称	引物		序列（5'→3'）
miR-98	RT引物		GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACAACAAT
	PCR引物	正向	CTGAGCGGTGAGGTAGTAAGTTGTA
		反向	ATTCCATGAGAGATCCCTAGCGT
miR-24	RT引物		GTCGCATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTCAACGAATGCGACCTGTTC
	PCR引物	正向	ACTAAGCTGGCTCAGTTCAGCAGG
		反向	ATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGT
miR-320a	RT引物		GTCGCATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTCAACGAATGCGACTCGCCC
	PCR引物	正向	ACTATGGAAAAGCTGGGTTGAGAG
		反向	ATTCGTTGAGAGATCACAAGCGT
miR-320c	RT引物		GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACACCCTC
	PCR引物	正向	ACTAAGCGAAAAGCTGGGTTGAG
		反向	ATTCCATGAGAGATCCCTAGCGT
miR-23b	RT引物		GTCGCATTGCATGAGAGATCACTAGCGTCATGCAATGCGACGGTAAT
	PCR引物	正向	ACTAAGATCACATTGCCAGGGA
		反向	ATTGCATGAGAGATCACTAGCGT
miR-509-3p	RT引物		GTCGCATTCCTTGAGAGATGACTACCGACAAGGAATGCGACCTACCC
	PCR引物	正向	ACTTAGGTGATTGGTACGTCTGTG
		反向	ATTCCTTGAGAGATGACTACCGA

图1 两组样品总RNA 电泳图

表2 两组样品总RNA 和miRNA 的浓度及总量

样品	A ₂₆₀	A ₂₈₀	A ₂₆₀/A₂₈₀	总RNA浓度（μg/μl）	RNA总量（μg）	miRNA浓度（μg/μl）	miRNA总量（μg）
ACC-M	1.007	0.562	1.79	0.8056	80.56	0.0912	9.12
ACC-2	1.216	0.665	1.83	0.9728	97.28	0.1576	15.76

表2 两组样品总RNA 和miRNA 的浓度及总量

样品	A ₂₆₀	A ₂₈₀	A ₂₆₀/A₂₈₀	总RNA浓度（μg/μl）	RNA总量（μg）	miRNA浓度（μg/μl）	miRNA总量（μg）
ACC-M	1.007	0.562	1.79	0.8056	80.56	0.0912	9.12
ACC-2	1.216	0.665	1.83	0.9728	97.28	0.1576	15.76

表3 芯片上存在表达差异具有统计学意义的miRNA

编号	miRNA	ACC-M/ACC-2
1	hsa-miR-15a	2.11
2	hsa-miR-16	3.07
3	hsa-miR-181c	2.40
4	hsa-miR-22	3.11
5	hsa-miR-222	2.58
6	hsa-miR-801	2.03
7	hsa-miR-561	3.10
8	hsa-miR-29a	2.49
9	hsa-miR-342-3p	2.07
10	hsa-miR-378	2.07
11	hsa-miR-509-3p	3.75
12	hsa-miR-299-5p	3.11
13	hsa-miR-514	3.12
14	hsa-miR-518b	5.52
15	hsa-miR-24	0.50
16	hsa-miR-23b	0.43
17	hsa-miR-98	0.45
18	hsa-miR-320	0.50
19	hsa-miR-126	0.26
20	hsa-miR-187	0.20
21	hsa-miR-214	0.30
22	hsa-miR-29b	0.22
23	hsa-miR-877	0.31

表3 芯片上存在表达差异具有统计学意义的miRNA

编号	miRNA	ACC-M/ACC-2
1	hsa-miR-15a	2.11
2	hsa-miR-16	3.07
3	hsa-miR-181c	2.40
4	hsa-miR-22	3.11
5	hsa-miR-222	2.58
6	hsa-miR-801	2.03
7	hsa-miR-561	3.10
8	hsa-miR-29a	2.49
9	hsa-miR-342-3p	2.07
10	hsa-miR-378	2.07
11	hsa-miR-509-3p	3.75
12	hsa-miR-299-5p	3.11
13	hsa-miR-514	3.12
14	hsa-miR-518b	5.52
15	hsa-miR-24	0.50
16	hsa-miR-23b	0.43
17	hsa-miR-98	0.45
18	hsa-miR-320	0.50
19	hsa-miR-126	0.26
20	hsa-miR-187	0.20
21	hsa-miR-214	0.30
22	hsa-miR-29b	0.22
23	hsa-miR-877	0.31

图2 miRNA 芯片筛选数据图

图3 qRT-PCR 验证ACC-M 中几种miRNA 相对ACC2 的表达量变化

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