猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2008-02-003

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2008, Vol. 02 ›› Issue (02) : 116 -121. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2008-02-003

基础研究

猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建

程岚¹, 束蓉^,¹

^1. 200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙周科，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所

收稿日期:2007-12-03 出版日期:2008-04-01
通信作者: 束蓉
基金资助:
国家自然科学基金（30672315）

Construction of prokaryotic expression clone for pig amelogenin gene encoding mature peptide

Lan CHENG¹, Rong SHU^,¹

^1. Department of Periodontology， College of Stomatology，Ninth People's Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University, Shanghai Key Laboratory of Stomatology Shanghai Research Institute of Stomatology， Shanghai 200011， China

Received:2007-12-03 Published:2008-04-01
Corresponding author: Rong SHU

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目的

克隆猪釉原蛋白（pAm）成熟肽编码区基因片段，并构建含有该基因的重组原核表达质粒，为制备基因工程化的重组pAm 奠定基础。

方法

从新生小猪牙胚组织中抽提总RNA，逆转录合成牙胚cDNA，通过PCR 扩增pAm 成熟肽编码序列（约540 bp），所得目的基因插入表达载体质粒PGEX4T1，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒PGEX4T1-pAm 经双酶切和核苷酸序列分析鉴定。

结果

重组质粒PGEX4T1-pAm 经双酶切和测序鉴定证实载体质粒PGEX4T1 中插入的基因片段与pAm 成熟肽基因序列完全相同。

结论

从发育期猪牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列可成功构建含有pAm 成熟肽基因的重组表达质粒。

关键词: 釉原蛋白, 逆转录聚合酶链式反应, 重组质粒

Objective

To clone pig amelogenin gene encoding mature peptide， and construct prokaryotic expression clone which lay the foundation for expressing the recombinant pig amelogenin in Escherichia coli. in the future.

Methods

Total RNA was extracted from the dental germ of a nascent pig by Trizol. The cDNA fragment of pig Amelogenin gene was obtained with RT-PCR from total RNA. The segment was inserted into prokaryotic gene fusion vector PGEX4T1 and the interesting plasmid was transformed into Escherichia coli. host DH5α. The double-stranded DNA of positive clone was characterized by restriction endonuclease mapping and DNA sequence analysis.

Results

The sequence analysis of recombinant plasmid showed that the pig amelogenin encoding mature protein was inserted into vector PGEX4T1 accurately.

Conclusions

The recombinant prokaryotic expression plasmid PGEX4T1-pAm was successfully constructed by properly inserting pig amelogenin gene encoding mature peptide.

Key words: Amelogenin, RT-PCR, Recombinant plasmid

图1 总RNA 电泳图谱 1. 猪牙胚总RNA 电泳图谱； 2. 70℃水浴保温1 h 后的总RNA 电泳图谱

图2 Am 基因逆转录扩增产物 1. 样品： 1st strand cDNA 为模板RT-PCR 扩增pAm（约540 bp）； 2. 阴性对照：无菌水为模板的PCR 产物； 3. 管家基因对照： 1st strand cDNA 为模板RT-PCR 扩增β-actin（约400 bp）

图3 重组质粒酶切鉴定电泳图 1. 目的基因片段pAm； 2. 质粒PGEX4T1 经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切； 3.重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切

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