羟基喜树碱纳米微球抑制舌鳞癌Tca8113 细胞的实验研究

doi:10.3877 / cma.j.issn.1674-1366.2009-03-005

目的

探讨改良闭环羟基喜树碱（HCPT）药用剂型体外抑制口腔鳞癌细胞株的疗效。

方法

透析法制备载闭环羟基喜树碱/聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯（HCPT/PEG-PBLG）纳米微球，与HCPT 羧酸钠盐分别作用于Tca8113 细胞，对比观察细胞形态学改变，MTT 检测细胞毒作用，流式细胞仪、DNA 凝胶电泳检测细胞周期变化及细胞凋亡。

结果

成功制备HCPT/PEG-PBLG 纳米微球，包封率56.8%；载药率7.5%。 Tca8113 细胞经HCPT 和HCPT/PEG-PBLG 分别作用后，显微镜形态学观察见细胞凋亡、生长抑制。 MTT 检测显示HCPT 呈现明显细胞毒作用；HCPT 纳米微球剂型组48 h 时生长抑制率低于HCPT 普通剂型组（P≤0.01），至96 h 时则与HCPT 普通剂型组差异已无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞仪、DNA凝胶电泳检测细胞周期发生变化：HCPT 阻抑细胞于S 期，同时诱导细胞凋亡；HCPT/PEGPBLG 组细胞周期与HCPT 组改变类似，但S 期阻抑增加速度平缓，慢于后者。

结论

HCPT 对Tca8113 细胞具有较强的抑瘤作用，阻抑细胞周期于S 期并诱导细胞凋亡。 HCPT 纳米微球剂型具有药物缓释优点，体外实验作用平缓，终末抑瘤效果与HCPT 羧酸钠盐剂型持平。

关键词: 羟基喜树碱, 聚乙二醇, 聚谷氨酸苄酯, 口腔鳞状细胞癌, 纳米微球

Objective

To improve the pharmaceutical dosage form of Hydroxycamptothecine （HCPT） and to explore its suppressive effects and inhibitive mechanism on tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cell line in vitro.

Methods

The closed ring form HCPT-loaded PEG-PBLG nanoparticles were synthesized and tested. After affected by HCPT and HCPT/PEGPBLG respectively in vitro， Tca8113 cells' morphologic changes were observed， cytotoxicity effects were evaluated by MTT assay， the cell cycle and apoptosis changes were assessed with flow cytometry （FCM） and DNA gel electrophoresis.

Results

HCPT/PEG-PBLG nanoparticles had been successfully synthesized， with 56.8% in encapsulation efficiency and 7.5% in loading level. Tca8113 cells suppression and apoptosis were observed both in HCPT and HCPT/PEGPBLG group under microscope. Results of MTT assay showed that HCPT had been obvious toxic to Tca8113 cells. HCPT/PEG-PBLG showed similar effectiveness but relatively delayed at check point to that of HCPT： GI value was less than that of HCPT at 48 hours （P≤0.01） and equal to HCPT at 96 hours （no statistical significance was found）（P＞0.05）. FCM detected cell cycle variation： in HCPT groups， cells had been retarded in S phase and apoptosis rate raised.Compared with HCPT， HCPT/PEG-PBLG had similar effects while the velocity of the effectiveness was slow. DNA extraction and gel electrophoresis demonstrated classical DNA ladder mark of apoptosis induced by HCPT and HCPT/PEG-PBLG.

Conclusion

HCPT appeared to fairly restrained tumor growth of Tca8113 cell in vitro： delayed cell cycle in S phase and induced apoptosis. HCPT/ PEG-PBLG nanoparticles slowed down the drug release. So， compared wih HCPT， it showed more slight reactions and achieved the same final anti-tumor effects.

Key words: Hydroxycamptothecine （HCPT）, Poly ［ethylene glycol］（PEG）, Poly［γbenzyl-L-glutamate］（PBLG）, Oral Squamous Cell Carcinoma（OSCC）, Nanoparticles

图1 HCPT/PEG-PBLG 扫描电镜观测（×160 000）

图2 Tca8113 细胞HE 染色后显微镜观测（×400） A：PBS； B：PEG-PBLG； C：HCPT； D：HCPT/PEG-PBLG

图3 HCPT、HCPT/PEG-PBLG 体外Tca8113 细胞毒作用：细胞生长抑制率-48 h（n=6）

图4 HCPT、HCPT/PEG-PBLG 体外Tca8113 细胞毒作用：细胞生长抑制率-96 h（n=6）

表1 FCM 检测HCPT ＆ HCPT/PEG-PBLG 体外作用Tca8113 细胞周期影响和凋亡率（%）

浓度（mol/L）	空白对照组0	HCPT		HCPT/PEG-PBLG
浓度（mol/L）	空白对照组0	1×10^-8	1×10^-6	1×10^-8	1×10^-6
G0/G1期
24 h	60.60	58.90	7.00	55.70	66.40
48 h	59.10	13.60	0.00	64.70	2.70
72 h	45.30	2.10	0.00	18.80	0.60
S期
24 h	29.20	37.00	92.80	39.90	32.70
48 h	32.80	86.30	100.00	33.00	96.90
72 h	41.40	91.60	100.00	81.20	98.90
G2/M期	10.30	4.10	0.20	4.40	0.90
24 h	10.30	4.10	0.20	4.40	0.90
48 h	8.10	0.20	0.00	2.30	0.40
72 h	13.30	6.30	0.00	0.00	0.50
凋亡率
24 h	2.10	7.50	12.40	7.30	8.90
48 h	3.50	13.60	17.90	9.40	16.70
72 h	4.20	22.80	27.70	9.30	26.90

表1 FCM 检测HCPT ＆ HCPT/PEG-PBLG 体外作用Tca8113 细胞周期影响和凋亡率（%）

浓度（mol/L）	空白对照组0	HCPT		HCPT/PEG-PBLG
浓度（mol/L）	空白对照组0	1×10^-8	1×10^-6	1×10^-8	1×10^-6
G0/G1期
24 h	60.60	58.90	7.00	55.70	66.40
48 h	59.10	13.60	0.00	64.70	2.70
72 h	45.30	2.10	0.00	18.80	0.60
S期
24 h	29.20	37.00	92.80	39.90	32.70
48 h	32.80	86.30	100.00	33.00	96.90
72 h	41.40	91.60	100.00	81.20	98.90
G2/M期	10.30	4.10	0.20	4.40	0.90
24 h	10.30	4.10	0.20	4.40	0.90
48 h	8.10	0.20	0.00	2.30	0.40
72 h	13.30	6.30	0.00	0.00	0.50
凋亡率
24 h	2.10	7.50	12.40	7.30	8.90
48 h	3.50	13.60	17.90	9.40	16.70
72 h	4.20	22.80	27.70	9.30	26.90

图5 Tca8113 HCPT ＆HCPT/PEG-PBLG 作用后DNA 凝胶电泳 0：电泳标记物marker：λDNA/HindⅢ； 1：PBS 空白对照组48 h； 2：PBS 空白对照组96 h； 3：HCPT 48 h； 4：HCPT 96 h；5：HCPT/PEG-PBLG 48 h； 6：HCPT/PEG-PBLG 96 h.

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Experimental study on the effect of Hydroxycamptothecine-loaded Nanoparticles on tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cell line

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