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中华口腔医学研究杂志(电子版)

中华口腔医学研究杂志(电子版) ›› 2024, Vol. 18 ›› Issue (01) : 12 -21. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2024.01.003

论著

人牙源干细胞数据独立采集蛋白质组学方法的建立
刘雨晴, 顾永春, 孟凡文, 张素萍†()   
  1. 苏州大学唐仲英医学研究院，苏州　215124
    苏州大学附属第九医院口腔科，苏州　215200
    苏州口腔医院，苏州　215005
    苏州大学唐仲英医学研究院，苏州　215124；苏州市疾病预防控制中心，苏州　215004
  • 收稿日期:2023-06-28 出版日期:2024-02-01
  • 通信作者: 张素萍

Establishment of data independent acquisition quantification proteomic method in dental stem cells

Yuqing Liu, Yongchun Gu, Fanwen Meng, Suping Zhang†()   

  1. Cyrus Tang Medical Institute, Soochow University, Suzhou 215124, China
    Suzhou Ninth Hospital Affiliated with Soochow University, Suzhou 215200, China
    Suzhou Stomatological Hospital, Suzhou 215005, China
    Cyrus Tang Medical Institute, Soochow University, Suzhou 215124, China; Suzhou Center for Disease Control and Prevention, Suzhou 215004, China
  • Received:2023-06-28 Published:2024-02-01
  • Corresponding author: Suping Zhang
  • Supported by:
    Suzhou Gusu Health Talent Project(SYSD2019067)
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引用本文：

刘雨晴, 顾永春, 孟凡文, 张素萍. 人牙源干细胞数据独立采集蛋白质组学方法的建立[J]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2024, 18(01): 12-21.

Yuqing Liu, Yongchun Gu, Fanwen Meng, Suping Zhang. Establishment of data independent acquisition quantification proteomic method in dental stem cells[J]. Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition), 2024, 18(01): 12-21.

目的

探讨人牙源性干细胞（DSC）的数据独立采集（DIA）蛋白质组学的建立方法。

方法

2021年8月至2022年9月于苏州口腔医院收集牙齿，培养来自不同个体的牙髓干细胞（DPSC）、牙龈间充质干细胞（GMSC）、牙周膜干细胞（PDLSC）、根尖乳头干细胞（SCAP）和人脱落乳牙来源的干细胞（SHED），每种细胞各3个样本，共计15个样本进行DIA蛋白组学测序。通过唯一肽段分布和蛋白质覆盖分布、蛋白质质量分布评估蛋白质鉴定结果，通过组内变异系数（CV）、主成分分析及样本定量相关性等方面来评估DIA数据的质量。

结果

从细胞中提取的蛋白质样本合格，总样本中共鉴定出8 662个蛋白质。蛋白质鉴定的基本统计表明所鉴定的蛋白质是可靠的。差异蛋白分析显示，DSPC组与其他各组（GMSC、PDLSC、SCAP和SHED）比较，上调和下调的蛋白分别为125、168、100、102和106、107、94、107个。差异蛋白的热图显示，同DPSC比较，GMSC、PDLSC、SCAP和SHED均有不同高表达的蛋白图谱。京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）分析表明不同DSC的蛋白质富集在不同的信号通路。

结论

本研究成功建立了不同DSC的DIA蛋白质组学分析方法，为后续研究奠定了基础。

关键词: 干细胞, 人牙源性干细胞, 数据独立采集, 蛋白质组学
Objectives

To establish the data independent acquisition (DIA) proteomic method for dental stem cells.

Methods

Dental pulp stem cells (DPSC), mesenchymal stem cells derived from gingiva (GMSC), periodontal ligament stem cells (PDLSC), stem cells from apical papilla (SCAP), and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) from different individuals were collected from August 2021 to September 2022 in Suzhou Stomatological Hospital. A total of 15 samples with 3 in each type were used for the DIA detection and analysis. The results of protein identification were evaluated by unique peptide distribution, protein coverage distribution, and protein mass distribution. Intra-group coefficient of variation (CV), principal component analysis (PCA), and Pearson correlation coefficient of all protein expressions were used to evaluate DIA data quality.

Results

The results showed that the protein samples extracted from cells were qualified for DIA LC-MS analysis, and 8 662 proteins were identified in the total samples. The differential protein analysis showed that the upregulated and downregulated proteins between the DSPC group and other groups (DPSC vs GMSC, DPSC vs PDLSC, DPSC vs SCAP, and DPSC vs SHED) were 125, 168, 100, 102 and 106, 107, 94, 107, respectively. Heatmap of the differential proteins indicated that the other four dental stem cells had different protein profiles that were highly expressed compared to DPSC. The analysis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) showed that proteins from different dental stem cells were enriched in different signaling pathways.

Conclusions

We successfully established the DIA proteomics analysis method of different dental stem cells, which laid the foundation for future research.

Key words: Stem cells, Human dental stem cells, Data independent acquisition, Proteomics
图1 实验步骤与数据独立采集（DIA）工作流程　A：从细胞样本到蛋白质和DIA的实验程序示意图；B：DIA工作流程的卡通展示图；C：DIA数据分析的过程和内容示意图。LC-MS/MS：高效液相色谱串联质谱联用技术；DDA：数据依赖性采集；DIA：数据独立采集；GO：基因本体；COG/KOG：蛋白相邻类的聚簇/真核生物蛋白相邻类的聚簇。
图2 牙源性干细胞的蛋白质浓度及SDS-PAGE染色结果　A：5种牙源性干细胞（DSC）的蛋白质浓度，以Mean ± SEM表示（n = 3）；B：SDS-PAGE检测15个DSC的考马斯亮蓝染色结果。DPSC：牙髓干细胞；GMSC：牙龈间充质干细胞；PDLSC：牙周膜干细胞；SHED：人脱落乳牙来源的干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞。
图3 蛋白质的质谱鉴定结果　A：质谱鉴定得到的5种牙源性干细胞（DSC）的肽段和蛋白质数量；B：唯一肽段分布；C：蛋白质质量分布；D：蛋白质覆盖度分布。DPSC：牙髓干细胞；GMSC：牙龈间充质干细胞；PDLSC：牙周膜干细胞；SHED：人脱落乳牙来源的干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞。
图4 蛋白质组学样品质控　A：组内变异系数（CV）分布；B：样品相关性分析热图，计算每两个样本间所有蛋白质表达量的Pearson相关系数，以说明样本间蛋白质定量的相关性，X、Y轴均代表样本，颜色代表相关系数（颜色越深代表相关性越高；较浅的颜色表示相关性较低）；C：主成分分析，X轴是第一个主成分，Y轴是第二个主成分。DPSC：牙髓干细胞；GMSC：牙龈干细胞；PDLSC：牙周膜干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞；SHED：脱落乳牙来源的牙髓干细胞。
图5 差异蛋白与火山图　A：牙髓干细胞（DPSC）组与其他各组差异表达蛋白的直方图；B：DPSC与牙龈间充质干细胞（GMSC）差异蛋白的火山分布图，红点表示显著上调的蛋白质，绿点表示显著下调的蛋白质，灰点表示未发生显著变化的蛋白质。PDLSC：牙周膜干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞；SHED：脱落乳牙来源的牙髓干细胞。
图6 差异蛋白的聚类分析图　5种牙源性干细胞差异蛋白表达聚类分析采用行缩放法绘制热图。红色为高表达蛋白质，蓝色为低表达蛋白质，白色为中等表达蛋白质。DPSC：牙髓干细胞；PDLSC：牙周膜干细胞；GMSC：牙龈干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞；SHED：脱落乳牙来源的牙髓干细胞。
图7　4种比较组的韦恩图　DPSC：牙髓干细胞；PDLSC：牙周膜干细胞；GMSC：牙龈干细胞；SCAP：根尖乳头干细胞；SHED：脱落乳牙来源的牙髓干细胞。图8　4种牙源性干细胞（DSC）相比牙髓干细胞（DPSC）的差异蛋白京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集图　A：牙龈间充质干细胞（GMSC）特异性蛋白质的KEGG富集分析；B：牙周膜干细胞（PDLSC）特异性蛋白质的KEGG富集分析；C：根尖乳头干细胞（SCAP）特异性蛋白质的KEGG富集分析；D：人脱落乳牙来源的干细胞（SHED）特异性蛋白质的KEGG富集分析；E：4个比较组共同表达蛋白质的KEGG富集图；A1：Glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate；A2：Glycosylphosphatidylinositol（GPI）-anchor biosynthesis；A3：Glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series；A4：Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor。
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