渐进性咬合紊乱大鼠的髁突软骨中Ihh、Smo 及Ptch1 表达变化

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2014.03.004

目的

探讨Indian Hedgehog（Ihh）及其受体Smoothened（Smo）和Patched1（Ptch1）在渐进性咬合紊乱的大鼠髁突软骨-骨改建中的表达变化情况。

方法

选用24 只8 周龄雌性SD 大鼠，实验组施以渐进性咬合紊乱，分别于20 和24 周后取材，苏木精-伊红染色观察组织形态变化，免疫组化及实时定量PCR 方法检测Ihh、Smo 和Ptch1 的表达情况。

结果

髁突软骨后部20 周实验组明显增厚（F=4.39，P=0.003），但24 周组有所缓解。免疫组化检测24 周实验组Ihh 的表达水平高于对照组（F=3.78，P=0.02），而20 周实验组Smo 的表达水平高于对照组（F=5.16，P=0.04）。实时定量PCR 结果显示，20 周实验组Ihh（F=7.80，P=0.012）和Smo（F=15.67，P=0.003）的mRNA 水平均高于对照组；24 周实验组Ihh 的mRNA 水平表达水平显著高于对照组（F=13.34，P=0.013），Ptch1的表达差异无统计学意义（F=1.34，P=2.13）。

结论

渐进性咬合紊乱促进了大鼠髁突软骨中Ihh 及其受体Smo的高表达。

关键词: Ihh, Smo, Ptch1, 软骨, 颞下颌关节, 咬合

Objective

To explore the effects of experimentally created disordered occlusion（ECDO） on the expression of Indian Hedgehog （Ihh） and its receptors Patched1 （Ptch1） and Smoothened（Smo） in the mandibular condyle of SD rats.

Methods

Twenty four female SD rats （8-week old） were randomly divided into the experimental and the control groups. In experimental group， the progressive disordered occlusion was created by using orthodontic techniques. The rats were sacrificed on 20 weeks or on 24 weeks， respectively. HE staining was performed to detect the histological changes， and immunohistochemical analysis and real time-polymerase chain reaction were applied to evaluate the expression of Ihh， Ptch1 and Smo.

Results

On 20 weeks， the thickness of condylar cartilage in experimental group significantly increased （F=4.39， P=0.003） and eased down on 24 weeks. The immunohistochemical expression level of Ihh on 24 weeks was higher than that of the control group （F=3.78， P=0.02）， and the Smo expression on 20 weeks of the experimental group was higher than that of the control group （F=5.16， P=0.04）. Real time-PCR results showed that Ihh （F=7.80， P=0.012） and Smo （F=15.67， P=0.003）levels of mRNA in 20-week experimental group were higher than those of the control group； and also on 24 weeks the mRNA level of Ihh was significantly higher than that of the control group （F=13.34，P=0.013）. The expression of Pth1 showed no statistically significant difference between the experimental and the control group.

Conclusion

ECDO promoted higher expression of Ihh and its receptor Smo in mandibular condylar cartilage of rats.

Key words: Indian Hedgehog, Smoothened, Patched1, Cartilage, Temporomandibular joint, Occlusion

表1 Ihh、Smo 和Ptch1 引物

基因	引物序列
Ihh	上游：5'-CTTC AGCGATGTGCTCATTT-3'
	下游：5'-ATGATTGTCCGCAATGAAGA-3'
Smo	上游：5'-ACAGTTCAGGCCAATGTGAA-3'
	下游：5'-AAGGCTGCGATGTAACTGTG-3'
Ptch1	上游：5'-CTGCTGTGGTGGTGGTATTC-3'
	下游：5'-GGCTTGTGAAACAGCAGAAA-3'

表1 Ihh、Smo 和Ptch1 引物

基因	引物序列
Ihh	上游：5'-CTTC AGCGATGTGCTCATTT-3'
	下游：5'-ATGATTGTCCGCAATGAAGA-3'
Smo	上游：5'-ACAGTTCAGGCCAATGTGAA-3'
	下游：5'-AAGGCTGCGATGTAACTGTG-3'
Ptch1	上游：5'-CTGCTGTGGTGGTGGTATTC-3'
	下游：5'-GGCTTGTGAAACAGCAGAAA-3'

图1 SD 大鼠下颌髁突组织形态注：对照组20 周（图1A ～1B）和24 周（图1E ～1F）髁突各层细胞排列整齐，层次分明；实验组20 周（图1C～1D）和24 周（图1G ～1H）软骨层明显增厚，细胞成簇（图1D 中红色箭头所示），并出现无细胞区域（图1D 中黑色箭头所示）和细胞坏死早期（图1H 中黑色箭头所示）；取材部位为髁突中部层面后部组织；图1A、1C、1E、1G（苏木精-伊红 ×100），图1B、1D、1F、1H 为图1A、1C、1E、1G 方框位置放大图片（苏木精-伊红×400）

图2 SD 大鼠TMJ 髁突软骨厚度的比较注：图2A 为20 周，^aP＜0.05；图2B 为24 周，^aP＜0.05

图3 SD 大鼠TMJ 髁突软骨Ihh 免疫组化染色结果注：对照组20 周（图3A ～3B）髁突各层细胞排列整齐，层次分明；实验组20 周（图3C ～3D）软骨层明显增厚，细胞成簇（图3D中黑色箭头所示），并出现无细胞区域（图3D 中红色箭头所示）；对照组24 周（图3E ～3F）髁突各层细胞排列整齐，层次分明；实验组24 周（图3G ～3H）细胞排列紊乱；Ihh 免疫组化染色，取材部位为髁突中部层面后部组织；图1A、1C、1E、1G（×100），图1B、1D、1F、1H（×400）

图4 SD 大鼠TMJ 髁突软骨Smo 免疫组化染色结果注：对照组20 周（图4A ～4B）髁突各层细胞排列整齐，层次分明；实验组20 周（图4C ～4D）软骨层明显增厚（图4D 中黑色箭头所示），细胞周围明显黄染（图4D 中红色箭头所示）；对照组24 周（图4E ～4F）髁突各层细胞排列整齐，层次分明；实验组24 周（图4G ～4H）细胞排列紊乱；Smo 免疫组化染色，取材部位为髁突中部层面后部组织；图1A、1C、1E、1G（×100），图1B、1D、1F、1H（×400）

图5 SD 大鼠TMJ 髁突软骨Ptch1 免疫组化染色结果注：对照组20 周（图5A～5B）与实验组20 周（图5C～5D）、对照组24 周（图5E～5F）与实验组24 周（图5G～5H）差异均无统计学意义；图1A、1C、1E、1G（×100），图1B、1D、1F、1H（×400）

图6 20 周和24 周时，两组SD 大鼠TMJ 髁突软骨中Ihh、Smo 和Ptch1 免疫组化染色阳性细胞统计结果注：图6A 为Ihh，^aP₂₄ ＜0.05；图6B 为Smo，^aP₂₀ ＜0.05；图6C 为Ptch1，差异无统计学意义

图7 20 周和24 周时，两组SD 大鼠TMJ 髁突软骨实时定量PCR 结果注：图7A 为Ihh，^aP＜0.05；图7B 为Smo，^aP＜0.05；图7C 为Ptch1，差异无统计学意义，采用2^-△△CT 法对结果进行分析

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The expression changes of Ihh， Smo and Ptch1 on rat condylar cartilage in the experimentally created disordered occlusion

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