miR-146a 在人牙髓细胞中的表达及其作用研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2014.03.001

目的

检测miR-146a 在正常及脂多糖（LPS）刺激的人牙髓细胞（hDPC）中的表达，探讨miR-146a 对hDPC 分泌炎性因子的影响及其机制。

方法

（1）实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法测定正常及LPS 刺激的hDPC miR-146a 的表达水平。（2）Lipofectamine 2000 脂质体分别转染化学合成的miR-146a 类似物（miR-146a mimics）、miR-146a 抑制剂（miR-146a inhibitor）及其相应无关序列小RNA 对照，转染24 h 后1 μg/ml LPS 刺激hDPC，4 h 后实时荧光定量PCR 检测白细胞介素6（IL-6）、IL-8 mRNA 的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清IL-6、IL-8 的分泌；Western blot法检测miR-146a 下游靶标白细胞介素1 受体相关激酶1（IRAK1）及肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达水平。两组比较采用独立样本t 检验，多组比较采用方差分析。

结果

（1）经LPS 刺激的hDPC miR-146a 表达水平高于正常hDPC（12 h：t=8.488，P=0.014；24 h：t=39.661，P＜0.001）。（2）转染miR-146a mimics 的hDPC 在1 μg/ml LPS 刺激下产生炎性因子IL-6、IL-8 的水平低于阴性对照，差异有统计学意义（IL-6 PCR：P＜0.001，IL-6 ELISA：P＜0.001；IL-8 PCR：P＜0.001，IL-8 ELISA：P=0.011）；过表达miR-146a 后IRAK1 及TRAF6 蛋白水平明显下调（IRAK1：P=0.002；TRAF6：P＜0.001）。

结论

miR-146a 在LPS 刺激的hDPC 中表达上调，转染miR-146a 可下调其靶基因IRAK1及TRAF6表达并降低IL-6、IL-8 分泌，推测miR-146a 参与牙hDPC 的炎症反应调控。

关键词: miR-146a, 牙髓细胞, 脂多糖, 炎症因子

Objective

To investigate the expression of miR-146a in normal human dental pulp cells （hDPCs） and hDPCs stimulated by lipopolysaccharide （LPS）， and explore the possible role of miR-146a in pulpitis.

Methods

The expression levels of miR-146a in normal human dental pulp cells and hDPCs stimulated by LPS were detected by real-time PCR. Moreover， miR-146a mimics and miR-146a inhibitor， as well as their counterpart negative controls were transfected into cultured hDPCs by Lipofectamine 2000 for 24 h， followed by 1 μg/ml LPS stimulation for 4 h. MRNA of IL-6 and IL-8 were tested by real-time quantitative PCR， and IL-6 and IL-8 levels in the culture supernatant were detected by ELISA. Moreover， IRAK1 and TRAF6 which previously identified as actual target of miR-146a were examined by Western blot. Comparisons between groups were performed with t test or oneway ANOVA analysis.

Results

It was shown that miR-146a was significantly up-regulated in LPS treated hDPCs compared with normal hDPCs （12 h：t=8.488， P=0.014； 24 h：t=39.661， P＜0.01）.Up-regulation of miR-146a could decrease secretion of IL-6 and IL-8 both in mRNA and supernatant levels （IL-6 PCR： P＜0.001， IL-6 ELISA： P＜0.001； IL-8 PCR： P＜0.001， IL-8 ELISA：P=0.011）. The expression of IRAK1 and TRAF6 of hDPCs transfected with miR-146a mimics was obviously downregulated compared to those transfected with mimics control （IRAK1：P=0.002； TRAF6：P＜0.001）.

Conclusions

MiR-146a is up-regulated in hDPCs induced by LPS. Up-regulation of miR-146a could not only down-regulate IRAK1 and TRAF6 expression， but also decrease IL-6 and IL-8 Ievels. This indicates miR-146a may be involved in the regulation of pulpitis.

Key words: MiR-146a, Dental pulp cell, Lipopolysaccharide, Pro-inflammatory cytokines

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

基因	引物序列	产物大小（bp）
miR-146a	茎环：5'-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAACCCA-3'	73
	上游：5'-CCGCCGTGAGAACTGAATTCCA-3'
	下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'
U6	茎环：5'-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAAAAATAT-3'	94
	上游：5'-TTCCTCCGCAAGGATGACACGC-3'
	下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'
IL-6	上游：5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3'	149
	下游：5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3'
IL-8	上游：5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3'	112
	下游：5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
GADAH	上游：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'	101
	下游：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

基因	引物序列	产物大小（bp）
miR-146a	茎环：5'-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAACCCA-3'	73
	上游：5'-CCGCCGTGAGAACTGAATTCCA-3'
	下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'
U6	茎环：5'-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAAAAATAT-3'	94
	上游：5'-TTCCTCCGCAAGGATGACACGC-3'
	下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'
IL-6	上游：5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3'	149
	下游：5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3'
IL-8	上游：5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3'	112
	下游：5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
GADAH	上游：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'	101
	下游：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'

图1 1 μg/ml LPS 刺激hDPC 后miR-146a 表达的变化注：与0 h 对照组比较，^aP＜0.05

图2 不同浓度的Cy3-miRNA 转染hDPC 后的荧光分布注：（A）荧光分布（倒置荧光显微镜 × 100）；（B）细胞明场与Cy3 荧光（A）合成

图3 miR-146a mimics 和inhibitor 对hDPC 在1 μg/ml 脂多糖刺激下产生炎性因子的影响注：图3A 为实时荧光定量PCR 检测IL-6、IL-8 的mRNA 表达水平；图3B 为ELISA 检测上清液中IL-6、IL-8 的分泌水平（与NC/LPS-组比较，^aP＜0.05；与mimics control/LPS+对照组比较，^bP＜0.05）

图4 miR-146a mimics 和inhibitor 对hDPC 在1 μg/ml LPS刺激下IRAK1 及TRAF6 表达的影响注：灰度值分析显示，与mimics control 组相比，转染miR-146a mimics 的hDPC 经LPS 刺激后，IRAK1、TRAF6 蛋白表达水平降低（^aP＜0.05）；与inhibitor control 组相比，转染miR-146a inhibitor 的hDPC 经LPS 刺激后，IRAK1、TRAF6 蛋白表达水平增高（^bP＜0.05）

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A study on the expression and function of miR-146a in human dental pulp cells

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