Toll 样受体2 激动剂Pam3CSK4对人牙髓细胞表达细胞因子的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2013.05.001

目的

研究Toll 样受体2（TLR2）激动剂Pam3CSK4 对体外培养人牙髓细胞（hDPC）表达细胞因子的影响。

方法

特异性配体Pam3CSK4 体外活化hDPC 表面TLR2，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测不同时间处理后hDPC 内白细胞介素6（IL-6）、IL-8、IL-1β 及半胱氨酸-X-半胱氨酸趋化因子配体10（CXCL10） mRNA 的表达水平；双抗体夹心ELISA 法检测上述细胞上清液中IL-6、IL-8 蛋白的表达水平；激光共聚焦观察TLR2-核因子κB（NF-κB）信号通路关键蛋白p65 的胞内分布情况。

结果

1 μg/ml Pam3CSK4 处理hDPC 0、4、8、12 h，荧光定量PCR 结果显示，除IL-6 mRNA 表达水平最先于4 h 达峰值外（P=0.006），IL-8、IL-1β 及CXCL10 mRNA 表达水平均于4 h开始升高，8 h 达峰值（P＜0.001）；双抗体夹心ELISA 法显示，hDPC 上清液中IL-6 及IL-8 的蛋白表达于4 h 开始升高，8 ～12 h 趋于平稳。激光共聚焦显微镜发现，表达绿色荧光的NF-κB p65 蛋白主要位于对照组细胞质，经1 μg/ml Pam3CSK4 刺激75 min 后转移至胞核。

结论

特异性配体Pam3CSK4 通过结合hDPC 表面TLR2 启动细胞内NF-κB 信号通路进而激活其转录作用，诱导hDPC表达多种细胞因子，从而参与牙髓炎的早期免疫调控。

关键词: 人牙髓细胞, Toll 样受体2, Pam3CSK4, 细胞因子, 核因子κB

Objective

This study was to investigate the effect of Toll-like receptor 2 agonist Pam3CSK4 on the expression of several cytokines in human dental pulp cells （hDPCs）.

Methods

The mRNA expression of IL-6， IL-8， IL-1β and CXCL10， and the protein expression of IL-6， IL-8 in hDPCs with 1 μg/ml Pam3CSK4 at different time points were examined by real-time quantitative PCR and ELISA， respectively. Nuclear location of p65 was investigated by immunofluorescent staining in hDPCs.

Results

The mRNA expression of IL-6 firstly elevated at 4 h， whereas the expression of IL-8，IL-1β and CXCL10 peaked at 8 hours by the incubation with 1 μg/ml Pam3CSK4. IL-6 and IL-8 proteins were clearly expressed in hDPCs culture supernatant， which increased at 4 h and maintained stable at 8 h. Confocal laser scanning microscope showed the positive expression of p65 in nuclear with 1 μg/ml Pam3CSK4 for 75 min， whereas p65 was only observed in cytoplasm in untreated control group.

Conclusions

Activation of TLR2 by Pam3CSK4 induced the expression of several cytokines both at mRNA and protein levels at 4 ～8 h through promoting NF-κB activation in hDPCs， indicating they may be involved in immune regulation of early pulpitis.

Key words: Human dental pulp cells, Toll-like receptor 2, Pam3CSK4, Cytokines, Nuclear factor-κB

表1 实时定量PCR 引物序列

基因	引物序列
CXCL10	正向：5'-CACCATGAATCAAACTGCGA-3'
	反向：5'-GCTGATGCAGGTACAGCGT-3'
IL-1β	正向：5'-GAAGCTGATGGCCCTAAACA-3'
	反向：5'-AAGCCCTTGCTGTAGTGGTG-3'
IL-6	正向：5'-AGTGAGGAACAAGCCAGAGC-3'
	反向：5'-GTCAGGGGTGGTTATTGCAT-3'
IL-8	正向：5'-TCCTGATTTCTGCAGCTCTGT-3'
	反向：5'-AAATTTGGGGTGGAAAGGTT-3'
GADPH	正向：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'
	反向：5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'

表1 实时定量PCR 引物序列

基因	引物序列
CXCL10	正向：5'-CACCATGAATCAAACTGCGA-3'
	反向：5'-GCTGATGCAGGTACAGCGT-3'
IL-1β	正向：5'-GAAGCTGATGGCCCTAAACA-3'
	反向：5'-AAGCCCTTGCTGTAGTGGTG-3'
IL-6	正向：5'-AGTGAGGAACAAGCCAGAGC-3'
	反向：5'-GTCAGGGGTGGTTATTGCAT-3'
IL-8	正向：5'-TCCTGATTTCTGCAGCTCTGT-3'
	反向：5'-AAATTTGGGGTGGAAAGGTT-3'
GADPH	正向：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'
	反向：5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'

图1 Pam3CSK4 作用不同时间对hDPC 中细胞因子表达水平的影响注：与0 h 对照组比较差异有统计学意义（^aP＜0.05）

图2 Pam3CSK4 作用hDPC 不同时间上清液中IL-6 及IL-8的检测注：与0 h 对照组比较，IL-6、IL-8 表达差异均有统计学意义（^aP＜0.05）

图3 Pam3CSK4 作用hDPC 不同时间p65 蛋白核转位情况（DAPI × 400）注：白色箭头示细胞胞核内绿色荧光呈强阳性

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