miR-135b 和miR-335 在不同年龄人牙髓细胞成牙本质向分化中的差异表达

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2013.02.002

目的

探讨不同年龄阶段人牙髓细胞（HDPCs）在矿化诱导前后miR-135b 和miR-335的表达变化，及其在HDPCs 分化中的作用。

方法

提取青年（18 ～22 岁）及中年（46 ～48 岁）临床就诊患者第三磨牙的HDPCs，经体外培养至第3 代后，用矿化诱导液诱导细胞向成牙本质细胞方向分化，对细胞结节形成情况进行观察并用Von Kossa 染色、碱性磷酸酶检测确定HDPCs 分化情况，分别取培养0、7、14、21 和28 d 的细胞用定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-135b和miR-335 的表达变化。

结果

青年组HDPCs 中miR-135b 和miR-335 显著高于中年组（P＜0.05）；经矿化诱导后，青年组miR-135b 和miR-335 表达逐渐降低（P＜0.05），而中年组miR-135b 表达上升，miR-335 表达则维持在低水平。

结论

miR-135b 和miR-335 在不同年龄阶段HDPCs 中差异表达，可能在HDPCs 成牙本质向分化中具有重要作用。

关键词: 牙髓细胞, 成牙本质向分化, 微小RNA, miR-135b, miR-335

Objective

To identify the expression of miR-135b and miR-335 of age-related in ages human dental pulp cells （HDPCs） during odontogenic differentiation.

Methods

Human dental pulp cells from youth adults （18-22 years） and middle-aged adults （46-48 years） were isolated，cultured and identified in vitro，the expression of miR-135b and miR-335 in HDPCs were examined during odontogenic differentiation by qRT-PCR. The formation of cellular nodules were determined. The cell differentiation was evaluated by Von Kossa staining and activity of alkaline phosphatase.

Results

The expression of miR-135b and miR-335 in youth HDPCs was significantly higher than that of middleaged group （P＜0.05）. The miR-135b and miR-335 expression in youth HDPCs gradually decreased with the cell passage and odontoblasts directional differentiation （P＜0.05）. In contrast，the expression of miRNA-135b was significantly increased in cell with differentiation in middle-aged HDPCs （P＜0.05）.

Conclusion

The expression of miR-135b and miR-335 might play important roles in agerelated human dental pulp cells during directional differentiation into odontoblastic cell.

Key words: Dental pulp cells, Odontoblastic differentiation, miRNA, miR-135b, miR-335

表1 引物序列

miRNA及启动子	引物序列
hsa-miR-135b	F：5'-ACACTCCAGCTGGGTATGGCTTTTCATTCCT-3'
hsa-miR-335	F：5'-ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAAA-3'
miRNA	R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'
U6	F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'
U6	R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

表1 引物序列

miRNA及启动子	引物序列
hsa-miR-135b	F：5'-ACACTCCAGCTGGGTATGGCTTTTCATTCCT-3'
hsa-miR-335	F：5'-ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAAA-3'
miRNA	R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'
U6	F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'
U6	R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

图1 HDPCs 矿化诱导前后形态学观察（Von Kossa × 50）矿化结节成深褐或黑色，细胞基质成浅灰色，结果显示，青年组牙髓细胞矿化诱导后7 d 染色呈弱阳性（C），14 d 形成明显矿化结节（E）；中年组牙髓细胞矿化诱导后7 d 无明显结节形成（D），14 d 形成少量矿化结节（F）；对照组（7 d 未矿化，A、B）染色结果呈阴性

图2 不同年龄阶段HDPCs 诱导分化过程中ALP 活性变化青年组牙髓细胞分化5 d 始ALP 活性增强（P＜0.01），11 d 达峰值，随后逐渐降低并持续在较稳定水平；而中年组牙髓细胞分化7 d始ALP 活性增强（P＜0.01），17 d 达峰值，随后迅速降低（与同组0 天组进行组间比较，^aP＜0.01）

图3 miR-135b 在牙髓细胞矿化诱导过程中的表达青年组miR-135b 经矿化诱导后表达降低，中年组miR-135b 经矿化诱导后表达上调（^aP＜0.05；与同组0 d 相比，^bP＜0.01）

图4 miR-335 在牙髓细胞矿化诱导过程中的表达青年组miR-335 经矿化诱导后表达降低，中年组miR-335 经矿化诱导后表达无明显变化（^aP＜0.05；与同组0 d 相比，^bP＜0.01）

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