人牙周韧带细胞膜片的体外实验研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2013.01.008

目的

观察体外培养人牙周韧带细胞（hPDLCs）的成骨、成脂能力；构建hPDLCs 膜片并鉴定膜片细胞外基质的主要结构蛋白。

方法

通过酶联组织块法分离并纯化培养hPDLCs；免疫细胞化学法鉴定hPDLCs 来源及干细胞标志物STRO-1 表达情况；取第2 ～4 代细胞分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养，茜素红及油红O 染色检测hPDLCs 的成骨、成脂能力；制备成熟的hPDLCs 膜片，苏木素-伊红（HE）及免疫组织化学染色法鉴定膜片细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白的表达情况。

结果

经原代培养的hPDLCs 抗波形蛋白染色阳性，干细胞标志物STRO-1 染色阳性，证实hPDLCs 来源于间充质并具有干细胞潜在分化能力；hPDLCs 在诱导成骨、成脂分化培养14 ～16 d 后，茜素红及油红O 染色结果阳性提示hPDLCs 具有良好的成骨及成脂分化能力；HE 染色及免疫化学染色发现hPDLCs 膜片高表达细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白。

结论

本研究从细胞分离培养，来源鉴定、多向分化潜能诱导及细胞膜片技术等方面证实PDLCs 中存在成体干细胞，提示hPDLCs 膜片能为牙周组织再生种子细胞提供新来源，可进一步深入研究。

关键词: 人牙周韧带细胞, 细胞膜片, 牙周组织再生

Objective

To investigate human periodontal ligament cells' capacities of osteogenesis and adipogenesis，and to identify the expression of type-I collagen，laminin and fibronectin which are the main components of extracellular matrix in human periodontal ligament cell sheet through establish cell sheet model in vitro experiment.

Methods

Human periondontal ligament cells were purified and cultured by using enzymes digesting/tissue culture method. Immunocytochemistry was applied to identify the source and putative stem-cell marker STRO-1 of hPDLCs. The second to fourth passages of hPDLCs were cultured in the osteogenic medium and adipogenic medium for indicated days. Alizarin red and Oil red O staining method were applied to identify capabilities of osteogenesis and adipogenesis of hPDLCs.Haematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry were applied to identify expression of type-Ⅰcollagen，laminin and fibronectin in hPDLCs cell sheet.

Results

The cultured hPDLCs demonstrated extensive proliferation and could be expanded in vitro. Immunostaining demonstrated that the cells expressed intermediate filament protein vimentin and the mesenchymal stem-cell marker STRO-1. hPDLCs in the osteogenic medium formed alizarin red-positive nodules. When hPDLCs were incubated in adipogenic medium，the cells developed into oil red O-positive lipid clusters and a significant high expression of type-Ⅰ collagen，laminin and fibronectin in human periodontalligament cell sheet.

Conclusions

Our findings confirm that hPDLCs contained stem cells population from culture，source identification，expression of the mesenchymai stem cell marker STRO-1，multilineage differentiation potent under defined culture conditions. Our study indicates that the hPDLCs turn out to be an efficient source and cell sheet to be an excellent bio-material that can be used for periodontal tissue regeneration.

Key words: Human periodontal ligament cells, Cell sheet, Periodontal regeneration

图1 人牙周韧带细胞分离、培养与鉴定 A：完整拔除的人第三磨牙；B：hPDLCs 呈纤维样紧密排列漩涡样生长（×100）；C：hPDLCs 抗波形蛋白免疫细胞化学染色阳性（×100）；D：hPDLCs 抗角形蛋白免疫细胞化学染色阴性（×100）；E：hPDLCs 抗Strol-1 免疫细胞化学染色阳性（×200）

图2 人牙周韧带细胞成骨诱导（茜素红染色 ×100） A：hPDLCs 对照组；B：hPDLCs 成骨诱导分化第3 天，细胞内颗粒增多；C：hPDLCs成骨诱导分化第8 天，细胞间钙质沉积；D：hPDLCs 成骨诱导分化第12 天，形成大量钙结节；E：茜素红染色阳性

图3 人牙周韧带细胞成脂诱导（油红O 染色 ×100） A：hPDLCs 对照组；B：hPDLCs 成脂诱导分化第8 天，细胞内脂滴出现；C：hPDLCs 成脂诱导分化第14 天，脂滴数量增加并融合；D：油红O 染色阳性

图4 成熟人牙周韧带细胞膜片大体观膜片呈乳白色外观，半透明状

图5 人牙周韧带细胞膜片组织学及免疫学鉴定（×200） A：hPDLCs 膜片HE 染色；B：hPDLCs 膜片抗层黏蛋白免疫组化染色阳性；C：hPDLCs 膜片抗纤连蛋白免疫组化染色阳性；D：hPDLCs 膜片抗Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色阳性

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