不同浓度重组人骨形成蛋白2 对人胎盘间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶表达的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2012.04.005

目的

初步探讨重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）作用于人胎盘间充质干细胞（HPDMSCs）的适宜浓度范围。

方法

取健康产妇自愿捐赠的胎盘，采用胶原酶消化法分离HPDMSCs，体外培养扩增并鉴定。取第3 代HPDMSCs，根据培养液中加入rhBMP-2 浓度的不同分为对照组（rhBMP-2 浓度为0）和实验A、B、C、D 组（rhBMP-2 浓度分别为50、100、150、200 ng/ml）。在加药后4、8、12、16 d采用CCK-8 法检测各组细胞增殖的吸光度值A₄₅₀，碱性磷酸酶（ALP）定量检测法检测酶表达的吸光度值A₅₂₀。

结果

获得的HPDMSCs 呈长梭形。CD29、CD44、CD105 表达阳性，CD34、CD45、CD106、HLA-DR 表达阴性。经鉴定，分离培养的细胞具有成骨和成脂的多向分化能力。 CCK-8 实验结果显示：A、B、C 组A₄₅₀ 与对照组相比，在所有时间点下差异均无统计学意义（P ＞0.05）；D 组A₄₅₀ 低于其它组，差异在大部分时间点有统计学意义（P＜0.05）。 ALP 检测结果显示：A、B、C、D 组A₅₂₀ 在所有时间点均高于对照组（P＜0.01）；B、C 组在8、12、16 d 高于其它组（P＜0.05）；B、C 组在所有时间点差异无统计学意义（P ＞0.05）。

结论

rhBMP-2 浓度在100 ～150 ng/ml 范围可有效诱导HPDMSCs 成骨向分化，且对HPDMSCs 增殖不产生明显影响。

关键词: 重组人骨形成蛋白2, 人胎盘间充质干细胞, 增殖, 碱性磷酸酶

Objective

To investigate the optimal concentration of recombinant human bone morphogenetic protein 2 （rhBMP-2） on cell perliferation and alkaline phosphatase （ALP） activity of human placenta-derived mesenchymal stem cells （HPDMSCs）.

Methods

The HPDMSCs were isolated by collagenase digestion from placentas donated by healthy mothers voluntarily. The cells were cultured and identified in vitro. HPDMSCs of the third generation were divided into 5 groups （control group，group A， B， C， and D） according to different concentrations of rhBMP-2 （0 ng/ml， 50 ng/ml， 100 ng/ml， 150 ng/ml， 200 ng/ml， respectively）. After 4 d， 8 d， 12 d and 16 d culture， CCK-8 assay were used to detect cell proliferation and ALP activity were measured quantitatively.

Results

Most HPDMSCs presented in long fusiform shape with positive expression of CD29， CD44 ， and CD105， and negative expression of CD34， CD45， CD106， and HLA-DR. They had osteogenic and adipogenic differentiation potential. No significant difference was found on A₄₅₀ value of group A，B， C and control group at different time points in CCK-8 assay （P ＞0.05）； while the A₄₅₀ value of group D was lower than that of the other four groups at most of the time points （P＜0.05）. The results of ALP quantitative measurement demonstrated that the A₅₂₀ value was significantly higher in all testing groups than in the control group at different time points （P＜0.01）. Moreover， the value of group B and C was found significantly higher than that in other groups at 8 d， 12 d， and 16 d after osteogenic induction with rhBMP-2 （P＜0.05）， while there was no significant difference between group B and group C at different time points （P ＞0.05）.

Conclusion

rhBMP-2 could improve HPDMSCs osteogenic differentiation at the dose within 100 ～150 ng/ml， but it could not affect proliferation significantly.

Key words: Recombinant human bone morphogenetic protein 2, Human placenta-derived mesenchymal stem cells, Proliferation, Alkaline phosphatase

图1 HPDMSCs 形态学观察（倒置相差显微镜 × 50） A. 原代培养5 d； B. 原代培养16 d； C. 第3 代细胞7 d

图2 HPDMSCs 的生长曲线

图3 流式细胞仪鉴定HPDMSCs 表型特征 A. CD34^-； B. CD45^-； C. CD106^-； D. HLA-DR^-； E. CD29⁺； F. CD44⁺； G. CD105⁺

图4 第3 代HPDMSCs 多向诱导分化鉴定 A. 成骨诱导培养21 d（Von Kossa × 100）箭头示黑色钙结节； B. 成脂诱导培养28 d（油红O × 400）箭头示红色脂质空泡

表1 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs 在不同时间点增殖的A₄₅₀ 值（n=16，±s）

组别	rhBMP-2 浓度（ng/ml）	4 d	8 d	12 d	16 d
空白对照组	0	0.419±0.041^d	0.670±0.083^d	0.611±0.082	0.563±0.053^d
A组	50	0.413±0.072^d	0.655±0.102^d	0.654±0.083^d	0.534±0.051
B组	100	0.391±0.054	0.663±0.078^d	0.660±0.079^d	0.546±0.050
C组	150	0.410±0.063^d	0.620±0.094	0.645±0.095^d	0.531±0.047
D组	200	0.355±0.042^ace	0.561±0.077^abe	0.569±0.107^abc	0.525±0.053^e
统计值		F=3.514	F=4.278	F=2.846	F=1.395
		P=0.011	P=0.004	P=0.030	P=0.244

表1 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs 在不同时间点增殖的A₄₅₀ 值（n=16，±s）

组别	rhBMP-2 浓度（ng/ml）	4 d	8 d	12 d	16 d
空白对照组	0	0.419±0.041^d	0.670±0.083^d	0.611±0.082	0.563±0.053^d
A组	50	0.413±0.072^d	0.655±0.102^d	0.654±0.083^d	0.534±0.051
B组	100	0.391±0.054	0.663±0.078^d	0.660±0.079^d	0.546±0.050
C组	150	0.410±0.063^d	0.620±0.094	0.645±0.095^d	0.531±0.047
D组	200	0.355±0.042^ace	0.561±0.077^abe	0.569±0.107^abc	0.525±0.053^e
统计值		F=3.514	F=4.278	F=2.846	F=1.395
		P=0.011	P=0.004	P=0.030	P=0.244

图5 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs 增殖的A₄₅₀ 值

表2 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs ALP 在不同时间点表达的A₅₂₀ 值（n=16，±s）

组别	rhBMP-2 浓度（ng/ml）	4 d	8 d	12 d	16 d
A组	0	0.201±0.047^abcd	0.186±0.053^abcd	0.199±0.043^abcd	0.188±0.042^abcd
B组	50	0.608±0.059^cde	0.609±0.072^bcde	0.697±0.039^bcde	0.627±0.042^bcde
C组	100	0.637±0.052^e	0.772±0.094^ae	0.810±0.042^ade	0.698±0.059^ae
D组	150	0.645±0.039^ae	0.777±0.070^ae	0.834±0.060^ade	0.717±0.051^ade
统计值	200	0.652±0.052^ae	0.736±0.094^ae	0.771±0.057^abce	0.679±0.056^ace
		F=241.179	F=162.793	F=468.977	F=309.964
		P=0.000	P=0.000	P=0.000	P=0.000

表2 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs ALP 在不同时间点表达的A₅₂₀ 值（n=16，±s）

组别	rhBMP-2 浓度（ng/ml）	4 d	8 d	12 d	16 d
A组	0	0.201±0.047^abcd	0.186±0.053^abcd	0.199±0.043^abcd	0.188±0.042^abcd
B组	50	0.608±0.059^cde	0.609±0.072^bcde	0.697±0.039^bcde	0.627±0.042^bcde
C组	100	0.637±0.052^e	0.772±0.094^ae	0.810±0.042^ade	0.698±0.059^ae
D组	150	0.645±0.039^ae	0.777±0.070^ae	0.834±0.060^ade	0.717±0.051^ade
统计值	200	0.652±0.052^ae	0.736±0.094^ae	0.771±0.057^abce	0.679±0.056^ace
		F=241.179	F=162.793	F=468.977	F=309.964
		P=0.000	P=0.000	P=0.000	P=0.000

图6 不同浓度rhBMP-2 作用下HPDMSCs ALP 表达的A₅₂₀ 值

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