成骨生长肽对体外人牙髓细胞增殖和矿化作用的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2011.03.004

目的

观察成骨生长肽（OGP）对体外人牙髓细胞增殖和矿化作用的影响。

方法

酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞（hDPCs），倒置相差显微镜观察hDPCs 的形态。CCK-8、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测筛选最佳浓度OGP；最佳浓度组、对照组、单纯矿化液组和含最佳浓度的矿化液组做茜素红、Von Kossa 染色和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测。

结果

酶消化组织块法可以良好的体外培养hDPCs；OGP 浓度在10^-7 ～10^-11 mol/L 均能促进hDPCs 增殖和ALP 活性：促增殖最佳浓度为10^-10 mol/L，随时间延长，与10^-9 mol/L 浓度组间差异无统计学意义；OGP 浓度为10^-9 mol/L 时能显著增强ALP 活性。茜素红和Von Kossa染色观察第14、21 天，四组均有钙化结节形成，联合组结节最大，数量最多；RT-PCR 结果显示第7、14、21 天，联合组的Ⅰ型胶原、牙本质涎磷蛋白（DSPP）和骨钙素（OCN）的mRNA 表达量均高于其他各组（P ＜0.01）。

结论

OGP 能促进体外hDPCs 的增殖和分化，结合两者最优浓度为10^-9 mol/L；茜素红和Von Kossa 染色可以观察钙化结节形成过程；OGP 联合矿化诱导液可以显著提高体外hDPCs 的矿化。

关键词: 成骨生长肽, 人牙髓细胞, 增殖作用, 矿化作用

Objective

To investigate the effect of osteogenic growth peptide on proliferation and mineralization of human dental pulp cells （hDPCs） in vitro.

Methods

The hDPCs were cultured in vitro with tissue-explants enzymatic digestion method.The morphological characters of the cells were observed by inverted microscope.We selected the best concentration of OGP beneficial to the proliferation and ALP activity of cultured hDPCs by using CCK-8 method and alkaline phosphatase activity test； Alizarin bordeaux and Von Kossa staining methods were used to observe the minera-lization nodules.RT-PCR test was used to detect relative RNA level of CollagenⅠ， DSPP and OCN.

Results

Tissue-explants enzymatic digestion method could cultivate hDPCs well in vitro； the maximum response was obtained with 10 ^-10 mol/L and 10^-9 mol/L by using CCK-8 method.However， the optimal concentration was 10 ^-9 mol/L by using alkaline phosphatase activity test.Alizarin bordeaux and Von Kossa staining cells cultured for 14 and 21 d，we discovered mineralization nodules in each group， but in the join group the nodules were more numerouse and larger.The results of RT-PCR test showed that mRNA level of CollagenⅠ， DSPP and OCN was higher in the join group.

Conclusions

OGP could promote the proliferation and mineralization of hDPCs in vitro， and the optimal concentration was 10^-9 mol/L when considering the two aspects.Alizarin bordeaux and Von Kossa staining methods could observe the mineralization nodules dramaticlly.Mineralization induced liquid containing OGP group could markedly improve the mineralization of hDPCs in vitro.

Key words: Osteogenic growth peptide, Human dental pulp cells, Proliferation, Mineralization

表1 实时定量聚合酶链反应引物序列

基因	引物序列
CollagenⅠ	Left Primer：5'-AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3'
	Right Primer：5'-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3'
DSPP	Left Primer：5'-GCCACTTTCAGTCTTCAAAGAGA-3'
	Right Primer：5'-GCCCAAATGCAAAAATATGTAA-3'
OCN	Left Primer：5'-CTCACACTCCTCGCCCTATT-3'
	Right Primer：5'-TTGGACACAAAGGCTGCAC-3'
GAPDH	Left Primer：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'
	Right Primer：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'

表1 实时定量聚合酶链反应引物序列

基因	引物序列
CollagenⅠ	Left Primer：5'-AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3'
	Right Primer：5'-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3'
DSPP	Left Primer：5'-GCCACTTTCAGTCTTCAAAGAGA-3'
	Right Primer：5'-GCCCAAATGCAAAAATATGTAA-3'
OCN	Left Primer：5'-CTCACACTCCTCGCCCTATT-3'
	Right Primer：5'-TTGGACACAAAGGCTGCAC-3'
GAPDH	Left Primer：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'
	Right Primer：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'

图1 体外培养第3 天少量hDPCs 从组织块旁边爬出（倒置显微镜 × 100）

图2 体外培养第5 天大量hDPCs 向外生长聚集（倒置显微镜 × 100）

图3 第3 代细胞形态较均一，排列成典型的“旋涡状”或束状（倒置显微镜 × 50）

表2 不同浓度OGP 对体外hDPCs 增殖率的影响（n=6，±s）

OGP 浓度（mol/L）	A 值
OGP 浓度（mol/L）	1 d	2 d	3 d	5 d
0	0.2485 ± 0.0518	0.3992 ± 0.0054	0.4606 ± 0.0067	0.5822 ± 0.0485
10^-7	0.2575 ± 0.0517	0.4177 ± 0.0056^a	0.4751 ± 0.0118^a	0.6178 ± 0.0197^a
10^-8	0.3241 ± 0.0542	0.4229 ± 0.0084^b	0.4804 ± 0.0105^b	0.6297 ± 0.0200^b
10^-9	0.4031 ± 0.0365^a	0.4412 ± 0.0036^b	0.5091 ± 0.0167^b	0.6465 ± 0.0126^b
10^-10	0.4057 ± 0.0530^b	0.4950 ± 0.0090^b	0.5187 ± 0.0114^b	0.6756 ± 0.0324^b
10^-11	0.3888 ± 0.0321^a	0.4318 ± 0.0060^b	0.4824 ± 0.0142^b	0.6401 ± 0.0153^b

表2 不同浓度OGP 对体外hDPCs 增殖率的影响（n=6，±s）

OGP 浓度（mol/L）	A 值
OGP 浓度（mol/L）	1 d	2 d	3 d	5 d
0	0.2485 ± 0.0518	0.3992 ± 0.0054	0.4606 ± 0.0067	0.5822 ± 0.0485
10^-7	0.2575 ± 0.0517	0.4177 ± 0.0056^a	0.4751 ± 0.0118^a	0.6178 ± 0.0197^a
10^-8	0.3241 ± 0.0542	0.4229 ± 0.0084^b	0.4804 ± 0.0105^b	0.6297 ± 0.0200^b
10^-9	0.4031 ± 0.0365^a	0.4412 ± 0.0036^b	0.5091 ± 0.0167^b	0.6465 ± 0.0126^b
10^-10	0.4057 ± 0.0530^b	0.4950 ± 0.0090^b	0.5187 ± 0.0114^b	0.6756 ± 0.0324^b
10^-11	0.3888 ± 0.0321^a	0.4318 ± 0.0060^b	0.4824 ± 0.0142^b	0.6401 ± 0.0153^b

表3 不同浓度OGP 对体外hDPCs 碱性磷酸酶活性的影响（n=5，±s）

OGP 浓度（mol/L）	A 值
OGP 浓度（mol/L）	1 d	3 d	5 d	7 d	10 d
0	0.1500 ± 0.0041	0.1599 ± 0.0045	0.1612 ± 0.0047	0.2046 ± 0.0026	0.6285 ± 0.0666
10^-7	0.1577 ± 0.0061^a	0.1603 ± 0.0075	0.1672 ± 0.0027	0.2291 ± 0.0173^a	0.8494 ± 0.1465^a
10^-8	0.1582 ± 0.0038^a	0.1677 ± 0.0055^a	0.1701 ± 0.0060^a	0.2476 ± 0.0143^b	0.8767 ± 0.1748^b
10^-9	0.1589 ± 0.0054^b	0.1694 ± 0.0055^b	0.1773 ± 0.0054^b	0.2661 ± 0.0112^b	0.9318 ± 0.1554^b
10^-10	0.1550 ± 0.0034	0.1634 ± 0.0030	0.1684 ± 0.0079^a	0.2382 ± 0.0135^b	0.8653 ± 0.1566^b
10^-11	0.1523 ± 0.0049	0.1629 ± 0.0029	0.1669 ± 0.0034	0.2361 ± 0.0208^b	0.8468 ± 0.1179^a

表3 不同浓度OGP 对体外hDPCs 碱性磷酸酶活性的影响（n=5，±s）

OGP 浓度（mol/L）	A 值
OGP 浓度（mol/L）	1 d	3 d	5 d	7 d	10 d
0	0.1500 ± 0.0041	0.1599 ± 0.0045	0.1612 ± 0.0047	0.2046 ± 0.0026	0.6285 ± 0.0666
10^-7	0.1577 ± 0.0061^a	0.1603 ± 0.0075	0.1672 ± 0.0027	0.2291 ± 0.0173^a	0.8494 ± 0.1465^a
10^-8	0.1582 ± 0.0038^a	0.1677 ± 0.0055^a	0.1701 ± 0.0060^a	0.2476 ± 0.0143^b	0.8767 ± 0.1748^b
10^-9	0.1589 ± 0.0054^b	0.1694 ± 0.0055^b	0.1773 ± 0.0054^b	0.2661 ± 0.0112^b	0.9318 ± 0.1554^b
10^-10	0.1550 ± 0.0034	0.1634 ± 0.0030	0.1684 ± 0.0079^a	0.2382 ± 0.0135^b	0.8653 ± 0.1566^b
10^-11	0.1523 ± 0.0049	0.1629 ± 0.0029	0.1669 ± 0.0034	0.2361 ± 0.0208^b	0.8468 ± 0.1179^a

图4 细胞培养后第7 天茜素红染色结果（倒置显微镜 × 100） A：对照组； B：因子组； C：单矿组； D 联合组

图5 细胞培养后第14 天茜素红染色结果（倒置显微镜 × 100） A：对照组； B：因子组； C：单矿组； D 联合组。箭头所指为矿化结节

图6 细胞培养后第21 天茜素红染色结果（倒置显微镜 × 100） A：对照组； B：因子组； C：单矿组； D 联合组。箭头所指为矿化结节

图7 细胞培养后第14 天Von Kossa 染色结果（倒置显微镜 × 200） A：对照组； B：因子组； C：单矿组； D 联合组。箭头所指为矿化结节

图8 细胞培养后第21 天Von Kossa 染色结果（倒置显微镜 × 200） A：对照组； B：因子组； C：单矿组； D 联合组。箭头所指为矿化结节

图9 第7 天各检测基因mRNA 相对表达量

图10 第14 天各检测基因mRNA 相对表达量

图11 第21 天各检测基因mRNA 相对表达量

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